耐高溫油脂降解菌株的篩選、鑒定及其在好氧堆肥中的應用*

詹亞斌 魏雨泉 陶興玲 張阿克 林永鋒 丁曉艷 范鑫祺 李 季#

(1.中國農業大學資源與環境學院，北京 100193；2.中國農業大學有機循環研究院(蘇州)，江蘇 蘇州 215100)

餐廚垃圾是我國主要的城市有機廢棄物之一，每年產生量約為9 000萬t[1]。隨著北京、上海、蘇州等地餐廚垃圾分類工作推進，餐廚垃圾收集量將持續增長，大量的餐廚垃圾如不及時處理，將會給居民的生產、生活帶來不利影響。分類后的餐廚垃圾含水率極高(通常在90%以上)，熱值極低[2]，增加了填埋、焚燒的處理難度和成本；填埋會污染地下水，占用土地，焚燒會污染大氣。好氧堆肥技術因其成本低、無害化程度高、處理能力大、處理后的產品可以直接施用于土壤，已經成為處理餐廚垃圾的一個重要手段[3]。

與畜禽糞便、園林垃圾、農業秸稈等廢棄物相比，餐廚垃圾具有獨特的性質，例如含油量高(1%(質量分數，下同)～5%，濕基)，這對餐廚垃圾好氧堆肥帶來了新的挑戰[4]。油脂會包裹在物料表面，阻礙微生物對物料碳水化合物、蛋白質等的降解，抑制餐廚垃圾好氧堆肥的啟動[5]。大量研究者嘗試將餐廚垃圾在前端去除油脂后進行堆肥，雖然效果尚可，但是費時費力，導致最終處理成本增大[6]。關于油脂降解菌的篩選報道很多，羅躍中等[7]篩選獲得一株菌，最適生長溫度為32 ℃，在液體培養基中培養3 d的油脂降解率為81.6%；康燕莉等[8]篩選獲得一株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，最適生長溫度為35 ℃，在液體培養基中培養2 d的油脂降解率為87.4%；這些微生物可以用來降解污水中的油脂；但是，可能無法應用于堆肥環境。餐廚垃圾好氧堆肥會經歷一個高溫過程，為了殺滅堆體中的病原菌，通常要求堆體維持高溫(>50 ℃)5 d以上。因此，要求接種的微生物對溫度有很好的耐受性。同時為了達到良好的油脂降解效果，一般要求接種的微生物從該種物料中篩選獲得，這樣有利于微生物的快速繁殖，從而達到快速降解油脂的目的。

本研究從餐廚垃圾好氧堆肥高溫期樣品中富集馴化、篩選獲得耐高溫油脂降解菌株，將其復配接種到餐廚垃圾堆肥中，期望降解餐廚垃圾中的油脂，加快餐廚垃圾好氧堆肥腐熟進程。本研究可為基于生物強化技術的餐廚垃圾資源化處理工藝奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株篩選樣品

菌株篩選樣品采集自中國農業大學有機循環研究院(蘇州)，取某次餐廚垃圾好氧堆肥高溫期樣品500 g，用于篩選耐高溫油脂降解菌株[9]。

1.2 培養基

富集培養基：大豆油(大豆油作為唯一碳源，質量濃度隨初篩中的周期逐次遞增，分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 g/L)，MgSO4·7H2O 0.1 g，(NH4)2SO41.0 g，KH2PO40.3 g，K2HPO41.5 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨固體培養基：牛肉膏蛋白胨培養基中添加20 g瓊脂粉。包括平板、斜面兩種類型。

中性紅培養基：牛肉膏蛋白胨固體培養基中添加1.6%(質量分數)中性紅水溶液1 mL、大豆油5.0 g。

油脂降解能力測定培養基：大豆油質量濃度為5.0 g/L，其他與富集培養基配方一致。

1.3 耐高溫油脂降解菌株的篩選及其油脂降解能力

(1) 油脂降解菌的初篩：稱量堆肥樣品5 g于45 mL富集培養基中，30 ℃、180 r/min培養6 d，然后吸取5 mL菌液于45 mL新的富集培養基中，相同條件下培養6 d，如此馴化5個周期。將第5個周期的菌液，稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板培養基上，挑選不同形態特征的菌落進行劃線分離，純化后的菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體斜面培養基中備用[10],[11]61。

(2) 油脂降解菌的復篩：將菌株接種于中性紅培養基上，30 ℃培養48 h，觀察菌落是否變紅，變紅則表示菌株能夠降解油脂并產生脂肪酸。

(3) 耐高溫油脂降解菌的篩選：將分離純化的菌株，接種于牛肉膏蛋白胨固體平板培養基中，分為3組，分別置于50、60、70 ℃培養箱中，48 h后觀察菌株的生長情況。將篩選出的菌株保存于牛肉膏蛋白胨固體斜面培養基中。

(4) 耐高溫油脂降解菌的油脂降解能力測定：將篩選出的菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體平板培養基中，30 ℃、180 r/min培養24 h，調節菌液使其在600 nm波長處的吸光值(OD600)為1.0，按照5%(體積分數，下同)接種量接種至油脂降解能力測定培養基中，30 ℃、180 r/min培養8 d，采用重量法測定大豆油的含量，計算油脂降解率[12]。

1.4 菌株的鑒定

采用煮沸法獲得DNA模板，送至上海某生物科技公司測序(16S rDNA)，引物分別為27F和1492R，將基因測序結果在GenBank中BLAST比對，采用MEGA 6.0對16S rDNA結果進行比對分析，并畫系統發育樹[11]63。

1.5 菌株拮抗實驗

采用牛津杯法對菌株(篩選得到的2株耐高溫油脂降解菌分別記為HBT-2和HBT-12)進行拮抗實驗。采用預加菌液傾注平板法，往已冷卻50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨固體平板培養基中接種20%的種子液(油脂降解菌在牛肉膏蛋白胨培養基中30 ℃、180 r/min培養2 d)，混合均勻，傾注凝固后備用。將已經滅菌的牛津杯置于實驗平板中，往牛津杯中加入10 μL種子液，30 ℃培養48 h，觀察菌株之間是否產生拮抗作用[13]。

1.6 堆肥材料

餐廚垃圾取自蘇州市某中學食堂，鋸末購買自蘇州市某木材廠，堆肥材料基本性質見表1。

表1 堆肥材料基本性質Table 1 Basic properties of composting materials

1.7 好氧堆肥

1.7.1 實驗設計

將餐廚垃圾與鋸末按照4∶1(濕基質量比)混合均勻，在長、寬、高、壁厚分別為67.5、48.0、41.0、3.5 cm的反應器中裝入60 kg堆肥材料，進行21 d的好氧堆肥。實驗一共設計2個處理，對照組(CK)不接菌，接種組接種1%菌液(2株菌體積比1∶1；菌株>108cfu/mL)；用接種環挑選一環微生物于100 mL牛肉膏蛋白胨培養基中，30 ℃、150 r/min培養24 h；將培養24 h的菌液作為種子液，接種于5 L牛肉膏蛋白胨培養基中，逐步擴大培養(按照2%的接種量對微生物擴大培養)；每個處理設置3個重復。分別于0、3、6、9、12、15、18、21 d在每個反應器中進行多點取樣，混合成一個樣后采用四分法收集樣品500 g,250 g保存于4 ℃備用，250 g風干、磨碎、過篩備用。每次取樣后進行人工翻堆。

1.7.2 測定方法

采用便攜式電子溫度計于每天9:00和15:00多點測定堆體溫度。含水率、pH和EC的測定參考《有機肥料》(NY 525—2012)進行?？傆袡C碳(TOC，質量分數)和總氮(TN，質量分數)采用元素分析儀(Vario EL)測定，C/N通過TOC和TN計算，C/N = TOC/TN[14]。發芽指數(GI)測定采用黃瓜種子發芽情況計算得出[15]。油脂采用重量法測定，具體參考文獻[11]。

2 結果與分析

2.1 耐高溫油脂降解菌株的篩選

篩選獲得的2株耐高溫油脂降解菌HBT-2、HBT-12最高耐受溫度分別為50、60 ℃，在油脂降解能力測定培養基上的油脂降解率分別為30.40%、27.45%。

2.2 油脂降解菌株的分子生物學鑒定

將菌株HBT-2和HBT-12的16S rDNA基因序列提交GenBank數據庫，獲取序列登錄號分別為MN443606和MN443611。菌株系統發育樹見圖1，菌株HBT-2和泛酸枝芽孢桿菌(Virgibacilluspantothenticus)PBBS3在同一分支上；菌株HBT-12和地衣芽孢桿菌DSM 13在同一分支上。因此，經初步鑒定，菌株HBT-2歸屬于枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)，HBT-12歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

圖1 菌株HBT-2和HBT-12的系統發育樹Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of HBT-2 and HBT-12

2.3 菌株拮抗實驗結果

2株菌之間沒有出現抑菌圈，說明2株菌之間沒有拮抗作用，因此可以將2株菌復配接入堆肥中。

2.4 堆肥理化指標

2.4.1 溫 度

溫度是堆肥過程的一個關鍵指標，通常通過溫度上升與否判別堆肥是否正常啟動，堆肥一般包含3個溫度變化階段：升溫期、高溫期、降溫期[16]。2個處理的溫度呈現先上升后下降的趨勢(見圖2)。1～3 d，2個處理的溫度較為平穩，可能是餐廚垃圾中油脂抑制了微生物的生長，導致溫度無法繼續上升。4～12 d，接種組和CK的溫度分別由46.7、45.4 ℃上升至最高溫度63.2、58.3 ℃，且接種組比CK的溫度高，兩者具有顯著性差異(p<0.05)；說明接種耐高溫油脂降解菌可以促進堆體升溫。13～21 d，2個處理的溫度呈現總體下降趨勢；14 d以后，接種組溫度比CK低。在整個堆肥過程中，CK的高溫持續時間為9 d(堆肥第8～16天)；接種組的高溫持續時間為10 d(堆肥第6～15天)，且其中有3 d的溫度>60 ℃，兩者均達到堆肥腐熟標準(參考NY 525—2012，下同)中對溫度的要求(>50 ℃，持續5 d以上)；說明接種耐高溫油脂降解菌可以使堆體提前2 d進入高溫期，提前1 d進入降溫期，且高溫持續時間更長，更有利于殺滅病原菌。當堆體溫度>60 ℃，接種的2株芽孢桿菌可能會休眠或者死亡；一旦溫度適宜，芽孢桿菌產生的孢子會立即復蘇，依然能降解堆肥中的油脂。因此，將芽孢桿菌接種于堆體是十分適宜的。堆肥過程中，也可以通過翻堆、補水等方式給堆體降溫，避免過高的溫度造成有益微生物的死亡，對好氧發酵產生不利影響。化黨領等[17]在豬糞堆肥研究中發現，翻堆可以促進堆體降溫，同時可以給堆體帶來大量氧氣，有利于微生物生長，可以促進堆肥腐熟進程。

圖2 堆肥中溫度隨時間的變化Fig.2 Change of temperature in composting with time

2.4.2 含水率

水分可以反映微生物的活躍程度，微生物生長、繁殖需要消耗大量水；同時，堆體在升溫過程中，會加快水分蒸發，從而使水分急劇減少。2個處理的含水率呈現下降趨勢，CK、接種組的含水率分別由0 d的69.36%、69.49%下降至21 d的53.55%、49.20%(見圖3)；在整個堆肥過程中，接種組的含水率均低于CK，說明接種耐高溫油脂降解菌可以促進含水率的下降。堆肥結束，2個處理的含水率均在45%以上，未達到腐熟標準(堆肥成品要求含水率<45%)，可能是堆體初始含水率過高(接近70%)導致的。王曉君等[18]3217在餐廚垃圾好氧堆肥研究中發現，添加不同比例輔料的3個處理的堆體初始含水率為60%～65%，經過14 d，含水率均下降至45%以下，達到堆肥腐熟對含水率的要求。因此，在堆肥初期可以加大輔料添加量，調整堆體初始含水率至65%以下，便于堆肥快速腐熟。

圖3 堆肥中含水率隨時間的變化Fig.3 Change of moisture content in composting with time

2.4.3 pH

堆肥材料的初始pH較低，在3.5以下；可能是餐廚垃圾在收集、儲存、運輸過程中經歷了厭氧發酵導致的[18]3216。一般情況下，隨著堆肥的進行，微生物開始分解蛋白質生成氨基酸，會導致pH略微下降；當氨基酸進一步脫氨基生成氨氮等堿性物質，會導致堆肥pH開始上升[19]。2個處理的pH呈上升趨勢(見圖4)，接種組和CK的pH分別由0 d的3.39、3.36上升至21 d的8.22、7.48；接種組的pH在12 d達到7.47，CK的pH在18 d達到7.11，接種組比CK提前6 d達到>7，說明接種耐高溫油脂降解菌可以促進堆肥pH的上升。

圖4 堆肥中pH隨時間的變化Fig.4 Change of pH in composting with time

2.4.4 EC

EC反映了堆肥浸提液中的離子濃度，腐熟標準中要求EC<4 mS/cm[20]。接種組的EC呈現先上升、后下降的趨勢，CK的EC呈現先上升、后保持平穩的趨勢(見圖5)。0～12 d，接種組和CK的EC呈上升趨勢，分別由2.70、2.69 mS/cm上升至4.62、4.42 mS/cm，可能是堆肥材料在降解過程中釋放礦物鹽分和銨根離子，導致EC上升；接種組的EC顯著大于CK(p<0.05)，說明接種促進了堆肥中有機大分子的分解。堆肥結束，接種組的EC下降至3.77 mS/cm，達到腐熟標準；CK的EC為4.32 mS/cm，未達到腐熟標準。可能是接種促進堆體CO2、NH3的揮發，胡敏酸物質和陽離子交換量的升高，導致EC下降[21]。

圖5 堆肥中EC隨時間的變化Fig.5 Change of EC in composting with time

2.4.5 TOC、TN、C/N

由圖6(a)可知，2個處理的TOC呈下降趨勢。在整個堆肥過程中，接種組的TOC顯著低于CK(p<0.05)；堆肥結束，接種組和CK的TOC分別降低了6.59百分點、3.01百分點；說明接種有利于TOC的降解，這與杜龍龍等[22]的研究結果相一致。

圖6 堆肥中TOC、TN、C/N隨時間的變化Fig.6 Changes of TOC，TN，C/N in composting with time

2個處理的TN呈現先下降、后上升的趨勢(見圖6(b))。0～6 d，2個處理的TN呈下降趨勢，接種組和CK的TN均由0 d的1.71%分別下降至6 d的1.51%、1.54%，分別下降了0.20百分點、0.17百分點；可能是接種促進了堆體的升溫、pH上升，導致氮以NH3的形式損失了。9～21 d，2個處理的TN呈上升趨勢，接種組和CK的TN分別由9 d的1.62%、1.46%上升至21 d的1.87%、1.78%，分別上升了0.25百分點和0.32百分點。

接種組的C/N呈現先平穩、后下降的趨勢，CK的C/N呈先上升、后下降的趨勢(見圖6(c))。0～6 d，接種組的C/N較為平穩，保持在28.07～28.29，可能是TOC降解速率與TN損失速率持平，導致C/N無較大變化；CK的C/N呈上升趨勢，由28.47上升至30.77，可能是TOC降解速率低于TN損失速率導致的。9～21 d，2個處理的C/N均呈下降趨勢，這可能是TOC的降解速率較大導致的；接種組的C/N比CK低，說明接種可以促進C/N的下降，有利于堆肥的腐熟。

2.4.6 GI

GI是重要的腐熟度評價指標之一。當GI>50%時可以認為堆肥對植物基本沒有毒害，當GI>80%時，可認為達到腐熟標準[23]。2個處理的GI均呈現先下降、后上升的趨勢(見圖7)。0～3 d，2個處理的GI呈下降趨勢，接種組和CK的GI分別由45.45%、45.61%下降至39.64%、41.04%，可能是因為在堆肥前期，微生物分解油脂，產生有機酸，抑制了GI的上升。6～21 d，2個處理的GI呈上升趨勢，且接種組始終顯著大于CK(p<0.05)；堆肥結束，接種組的GI上升到85.90%，達到腐熟標準；CK的GI為76.68%，未達到腐熟標準，說明接種可以促進堆肥的腐熟。

圖7 堆肥中GI隨時間的變化Fig.7 Change of GI in composting with time

2.5 油脂降解率

2個處理的油脂降解率呈上升趨勢(見圖8)。整個堆肥周期，接種組的油脂降解率顯著大于CK(p<0.05)。0～6 d，接種組和CK的油脂降解率分別上升至3.55%、5.67%，上升速率較慢，可能是堆肥前期微生物生長較慢，且微生物分解油脂產生脂肪酸等不利于微生物生長，導致油脂降解率較低。9～21 d，接種組和CK的油脂降解率迅速上升，分別由18.56%、5.75%上升至38.62%和26.51%，接種組比CK高12.11百分點，說明接種耐高溫油脂降解菌可以顯著促進堆肥油脂的降解(p<0.05)。接種組堆肥高溫期(第6～15天)油脂降解率占到整個降解率的73.78%，說明油脂降解主要發生在堆肥高溫期。可能是高溫可以使餐廚垃圾的固態動物油脂變成液態，加大微生物與油脂的接觸比表面積，從而提高油脂的降解效率[24]。

圖8 堆肥中油脂降解率隨時間的變化Fig.8 Change of oil degradation rate in composting with time

3 結 論

(1) 從餐廚垃圾堆肥中篩選獲得2株菌，分別記為HBT-2、HBT-12，其最高耐受溫度分別為50、60 ℃，在油脂降解能力測定培養基上的油脂降解率分別為30.40%、27.45%；經16S rDNA初步鑒定為枝芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬。

(2) 堆肥結束，接種組的EC為3.77 mS/cm，GI為85.90%，達到腐熟標準；CK的EC為4.32 mS/cm，GI為76.68%，未達到腐熟標準。

(3) 在堆肥結束，接種組的油脂降解率為38.62%，比CK的26.51%高12.11百分點，差異顯著(p<0.05)。接種組在高溫期(第6～15天)的油脂降解率占到整個堆肥周期的73.78%，說明油脂降解主要發生在堆肥高溫期。