60Co-γ 輻射對扁穗雀麥種子萌發及其幼苗生長的影響

袁 帥，董志曉，趙煜晗，楊 建，易莉美，聶 聰，凌 瑤，馬 嘯

（四川農業大學草業科技學院草業科學系,四川成都 611130）

輻射誘變具有安全、簡單、突變率高等特征，相較于傳統的育種方法，輻射誘變是擴大變異和選育優質新品種的行之有效的手段，且采用輻射誘變技術能夠得到傳統育種方法難以獲得的或者自然界中罕見的牧草新基因、新性狀，從而解決優異種質資源缺乏的問題[1]。目前，國內外研究主要以X、γ、α、β射線、紫外線和激光等作為輻射源，其中60Co-γ是輻射誘變最常用的方法之一，且已利用該方法育成了一系列高產、多抗的農作物新品種[2]。我國牧草育種工作一般是對野生資源進行大量評價，進而篩選出優異種質來選育品種，因其育種效率較低，所以急迫需要基于現有優良種質或品種進行人工創制優異的育種材料。在輻射誘變育種工作中，選擇合適的輻射劑量與輻射源是輻射誘變育種的重要前提。利用0～300 Gy 的60Co-γ 射線對無芒雀麥(Bromus inermis)進行處理，發現隨著輻射劑量的增加，種子活力指數、苗高和根長呈先升高后下降的趨勢，并在50 Gy 時各項指標測定值最大[3]。利用0～200 Gy 的60Co-γ 射 線 對 草 地 早 熟 禾(Poa pratensis)進行輻射處理，發現低劑量(50 Gy)對草地早熟禾種子萌發和幼苗葉片的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性有促進作用，高劑量則產生抑制作用[4]。利用UV-B射線對甘草(Glycyrrhiza uralensis)進行輻射處理，發現UV-B射線對甘草種子萌發率、發芽勢、幼苗株高、葉面積均有抑制作用，對幼苗的丙二醛(malondialdehyde,MDA)和脯氨酸(proline,Pro)含量則產生一定的促進作用[5]。

扁穗雀麥(B.catharticus)系禾本科(Poaceae)雀麥屬的一年生或短期多年生草本植物，具有產量高、綠期長、適口性優良及再生能力強等優點[6]，原生于南美洲潘帕斯草原，現在主要栽培于全球溫帶地區[7]。目前，國內外對扁穗雀麥的研究主要集中于鹽脅迫[8]、干旱脅迫[9]和低溫脅迫[10]等與抗逆相關的研究上，未見扁穗雀麥種子響應60Co-γ 輻射的生理生化研究。扁穗雀麥與輻射育種中較為成功的水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)和大麥(Hordeum vulgare)等植物同屬于禾本科，種子結構類似，因此其在輻射誘變育種上具備一定的可行性。鑒于此，探究不同輻射劑量處理對扁穗雀麥種子萌發以及早期幼苗生長的影響，關系到能否成功實現輻射M0代幼苗的建植，可為扁穗雀麥誘變輻射育種提供一定的科學依據及技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘川西’扁穗雀麥(2020年農業部審定品種)種子萌發率約為93%，由四川農業大學牧草課題組提供，于2016年收種保存在四川雅安?20℃冰箱中。種子在試驗前用2%的萎銹靈處理24 h，以預防黑穗病，再沖洗干凈后曬干待用。

1.2 試驗設計

1.2.1輻射處理

將扁穗雀麥種子于2020年9月送至四川省農科院生物技術核技術研究所進行60Co-γ 輻射處理，輻射率1.84 Gy·min?1，輻射劑量依次為0(對照)、50、100、150、200、250和300 Gy，共7個輻射處理，每個處理100 g 種子。

1.2.2幼苗培養

選取不同輻射劑量處理下的種子各50粒，浸泡于35℃蒸餾水中2 h，每個處理10個重復，置于鋪有兩層濾紙的培養皿中，加入適量蒸餾水(以沒過種子為宜)，并放入植物生長室進行培養，培養條件為日溫25℃ (16 h)、夜溫16℃(8 h)。在第4天發芽高峰期記錄發芽勢，在第7天萌發率不再變化時記錄萌發率。挑選出部分發芽種子移栽至加有石英砂和營養液的方形育苗盤中，繼續放于植物生長室，條件同種子萌發一致，培養14 d 后進行幼苗和根系形態及生理相關指標的測定。由于后期觀察到高輻射劑量處理后幼苗的畸變率非常高，難以建成完整的幼苗結構，所以幼苗的根系形態、幼苗的形態和生理指標均選用0～200 Gy 輻射處理下的幼苗進行測定。

1.3 指標測定及方法

1.3.1種子萌發指標

種子萌發指標包括發芽勢、萌發率，其計算方法為發芽勢=(種子第4天時的發芽數/供試種子總數)×100%，萌發率=(種子第7天時的發芽數/供試種子總數)×100%。

1.3.2半致死劑量

根據線性回歸方程式y=a+bx確定半致死劑量。式中：y代表不同輻射處理導致的幼苗死亡率，x代表不同輻射劑量[11]。

1.3.3根系形態參數測定

用數字化掃描儀(WinRHIZO_Pro2016)掃描各處理下的幼苗根系，再利用配套軟件WinRHIZO_Pro V2007d(Regent Instrument Inc.,Canada)獲取幼苗根長(cm)、表面積(cm2)、平均直徑(mm)和體積(cm3)等指標，每個處理10個重復。

1.3.4幼苗形態指標測定

將培養后處于三葉期的幼苗進行取樣，每個輻射劑量處理選取10株，利用游標卡尺測定葉寬(展開第2片真葉)和莖粗，直尺測定苗高和葉長(展開第1片真葉)，并計算各個輻射劑量處理的葉面積(葉面積校正系數0.73×葉長×葉寬)[12]。

1.3.5生理指標測定

取各輻射劑量處理的幼苗葉片，迅速放入液氮中，隨后存貯于?80℃超低溫冰箱中。依照《植物生理學實驗》[13]對MDA、Pro和葉綠素(chlorophyll, Chl)含量以及過氧化氫酶(catalase,CAT)和SOD 活性進行檢測，每個處理取3個重復樣本。

1.4 數據處理

試驗中幼苗及根系形態指標的數據采用SPSS 27.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan 新復極差法進行多重比較(P<0.05)，運用Excel 2019及GraphPad Prism 8進行繪圖。

為挑選出長勢較好且形態指標較對照變異均較大的輻射劑量，本研究運用隸屬函數法對各處理的各項指標進行綜合分析比較，計算公式[14]：正向隸屬函數值y=(xa?xmin)/(xmax?xmin)，負向隸屬函數值y=1?(xa?xmin)/(xmax?xmin)。式中：xa代表某一指標的值，xmax和xmin分別代表同一指標中的最大值與最小值。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ 輻射對種子萌發指標的影響

隨著輻射劑量的上升，扁穗雀麥種子發芽勢呈先升高后降低的趨勢(圖1)。在50 Gy 時種子發芽勢達到最大值，為32%，且與對照相比差異顯著(P<0.05)。隨著輻射劑量從50 Gy 升至300 Gy，種子發芽勢持續下降。當輻射劑量為150～300 Gy 時種子發芽勢均顯著低于對照(P<0.05)，輻射劑量超過200 Gy時種子發芽勢約下降至對照的10%。除50 Gy 處理下種子萌發率略高于對照外(P>0.05)，其余各輻射處理下均低于對照。隨著輻射劑量從50 Gy 升至300 Gy，種子萌發率持續下降，且在輻射劑量為200～300 Gy 時種子萌發率顯著低于對照(P<0.05)，與對照相比分別降低了22.98%、55.42%和66.27%(圖1)。上述結果表明，在低輻射(50 Gy)處理下，輻射對種子萌發率和發芽勢均有促進效應，而在高輻射(100～300 Gy)處理下，則對種子萌發具有不同程度的抑制作用，且輻射劑量在300 Gy 時抑制作用最強。

圖1 60Co-γ 輻射對扁穗雀麥種子萌發指標的影響Figure 1 Effects of 60Co-γ radiation on Bromus catharticus seed germination indices

2.2 輻射對幼苗植株和根系形態指標的影響

2.2.1輻射對幼苗形態的影響

隨著輻射劑量從50 Gy 升至200 Gy，幼苗高度和葉長持續下降(表1)。除50 Gy 處理下的幼苗苗高與50和100 Gy 處理下的幼苗葉長略高于對照外(P>0.05)，其余各輻射處理下幼苗苗高和葉長均低于對照。當輻射劑量達到150和200 Gy 時，苗高和葉長均顯著低于對照(P<0.05)。除150 Gy 處理下幼苗葉面積低于對照外，其余處理的葉寬、莖粗和葉面積均高于對照。當輻射劑量為100 Gy 時幼苗葉面積達到最大，200 Gy 時幼苗葉寬和莖粗達到最大，且葉寬及莖粗與對照組相比分別顯著增加了31.70%和42.27%(P<0.05)。總體來看，高輻射劑量會促使幼苗低矮化、葉片短粗化。

表1 60Co-γ 輻射對扁穗雀麥幼苗形態的影響Table 1 Effects of 60Co-γ radiation on the morphology of Bromus catharticus seedlings

2.2.2輻射對根系形態的影響

隨著輻射劑量從100 Gy 升至200 Gy，根系長度均顯著下降(P< 0.05)，與對照相比分別降低了30.44%、38.97%和69.29%(表2)。除50 Gy 處理下幼苗根長略高于對照外(P>0.05)，其余各輻射處理下的根長均低于對照。根系表面積和體積的變化均與輻射劑量的變化呈反比。當輻射劑量為200 Gy 時，根系表面積和體積均達到最小值，但根系平均直徑在各輻射處理下與對照之間無顯著差異(P> 0.05)。

表2 60Co-γ 輻射對扁穗雀麥根系形態的影響Table 2 Effectsof 60Co-γ radiation on root morphology of Bromuscatharticus

2.3 輻射對幼苗生理指標的影響

對不同輻射處理下扁穗雀麥幼苗葉片MDA 和Pro含量的分析比較發現，二者隨著輻射劑量的上升均表現出先上升后降低的趨勢(圖2)。輻射劑量從50 Gy 上升至200 Gy 時，MDA 含量相較于對照分別增加了12.55%、45.54%、102.73%和8.67%，Pro含量分別增加了84.64%、230.74%、166.06%和0.88%。當輻射條件分別為100和150 Gy 時葉片Pro和MDA含量顯著高于對照(P<0.05)，且值為最大。同時，幼苗抗氧化酶SOD及CAT 活性隨著輻射劑量的上升均表現出先上升后降低的趨勢(圖2)。在50 Gy時SOD活性達到最強，較對照顯著上升了14.79%(P<0.05)。在50～200 Gy 輻射劑量下，相較于對照而言，CAT 活性均有顯著提升(P< 0.05)，且在150 Gy時，CAT活性最強。

圖2 60Co-γ 輻射對扁穗雀麥生理指標的影響Figure2 Effects of 60Co-γ radiation on physiological indicesof Bromuscatharticus

2.4 輻射對幼苗葉片葉綠素含量的影響

隨著輻射劑量的升高，Chl a、Chl b和總Chl 含量均呈先上升后下降的趨勢(圖3)。當輻射劑量為50 Gy 時，Chl a、Chl b 和總Chl 含量均達到最大值，且顯著高于對照(P<0.05)；隨著輻射劑量從50 Gy升至200 Gy，Chl a、Chl b和總Chl含量均持續降低。在高輻射劑量(150和200 Gy)下，Chl a、Chl b和總Chl 含量相較于對照均顯著下降(P< 0.05)。

圖3 60Co-γ 輻射對扁穗雀麥幼苗葉片葉綠素含量的影響Figure 3 Effect of 60Co-γ radiation on leaf chlorophyll content in seedlings of Bromus catharticus

2.5 半致死劑量的確定

利用線性回歸方程式，繪制標準曲線，可得標準曲線方程為y= 0.199 3x+ 5.392 9，R2= 0.857 1(圖4)。把y=50代入方程式，求得x=223.82，即扁穗雀麥種子受60Co-γ 輻射的半致死劑量為223.82 Gy，約為224 Gy。當y≠50時，需要以實際對照種子的萌發率來計算。

圖4 輻射劑量與死亡率的一元線性回歸分析Figure 4 Univariate linear regression between radiation dose and percentage mortality

2.6 隸屬函數綜合分析

各輻射劑量處理下扁穗雀麥各指標的變化表現出一定程度上的相關性和差異性，且采用一種指標并不能全面地解釋輻射對扁穗雀麥種子萌發和幼苗生長的影響，所以需要對多指標進行綜合評價，以篩選出最適輻射劑量。根據各處理下測定的各項指標數值，包括2個萌發指標、5個幼苗形態指標、4 個根系形態指標和7個生理形態指標，計算其隸屬函數值(表3)，值越大，說明誘變后種子和幼苗的生長勢與活力越強。結果表明：不同輻射處理下平均隸屬函數值排序表現為50 Gy>100 Gy> 0 Gy>150 Gy>200 Gy>250 Gy>300 Gy，即50和100 Gy

表3 基于多指標利用隸屬函數分析評價扁穗雀麥種子輻射后生長效應Table3 Membership function analysisbased on multipleindicatorsfor theeffectsof radiation on Bromus catharticus

輻射劑量最適用于扁穗雀麥的輻射誘變育種，且后代存活率和生長勢較好。

3 討論與結論

本研究表明，60Co-γ 射線輻射對扁穗雀麥種子萌發及幼苗生長有顯著的影響。低輻射劑量(50 Gy)對扁穗雀麥種子萌發具有促進作用，此時種子的萌發指標及幼苗的苗高、葉長、葉寬、莖粗、葉面積和根系的長度、表面積均有提高；而高輻射劑量(100～300 Gy)對扁穗雀麥種子萌發有一定的抑制作用，且幼苗葉片出現黃葉和紫葉現象。在苜蓿(Medicago sativa)[15]和桂花(Osmanthus fragrans)[16]等植物的研究結果中也有類似情況。低輻射處理有助于種子的生長發育，這可能是因為種子內部有關酶的活性或生物自由基在合適的輻射劑量條件下發生改變，以加快種胚組織細胞的分裂與分化[17]；而高輻射處理可能會破壞種胚組織或改變種子內多種生理生化作用，從而降低了種子活力。

MDA 含量的高低可以作為植株個體受外界脅迫大小的衡量標準。當植株受到外界脅迫時，植株體內會出現膜脂過氧化作用，產生導致植株某些部位受損的膜質過氧化產物MDA，從而改變植株脂質過氧化的速度和強弱，其含量與植物受損程度呈正相關關系[18]。本研究中，隨著輻射劑量的上升，MDA含量表現出先升高后降低的趨勢，各處理的MDA含量均高于對照，在150 Gy 處理下MDA 含量達到最大值，說明不同劑量60Co-γ 射線處理均對扁穗雀麥幼苗造成了膜質過氧化損傷，致使機體活性氧與自由基積累增加，從而導致膜結構的完整性被破壞，且在150 Gy 輻射劑量下破壞程度最大，類似結果在白刺花(Sophora davidii)[19]和高羊茅(Festuca elata)[20]等飼用植物中也有報道。在200 Gy 下，MDA 含量有所降低，這也許是由于高輻射劑量(200 Gy)加強了植物體內某些修復酶活性，膜脂過氧化受到抑制，從而降低了植物受損的程度。Pro作為滲透調節物質，能夠增加細胞液濃度、降低滲透勢，從而增加植物對水分的吸收，同時能夠提高細胞膜的穩定性，從而在植物受到輻射或其他逆境脅迫時發揮重要作用[21]。本研究中，隨著輻射劑量的上升，Pro含量表現出先上升后下降的趨勢，表明中低輻射劑量下脯氨酸的積累對幼苗有一定的保護作用，而高劑量輻射下由于生理系統被強烈破壞導致脯氨酸含量下降。在繡球(Hydrangea macrophylla)[22]和無芒雀麥[23]的研究結果中也有類似情況。SOD作為一種保護酶，可以減少或消除超氧自由基對細胞膜的損害，其活力大小可以作為衡量植物抗氧化能力強弱的指標，屬于植物體內保護酶的組成成分之一[24]。CAT 屬于一種清除性酶類，具有抑制植物受H2O2毒害的作用，因為其可以促進H2O2分解為水和氧離子[25]。本研究中，隨著輻射劑量的上升，SOD與CAT 活性均表現出先升高后降低的趨勢，類似結果在露地菊(Chrysanthemum morifolium)[26]和草地早熟禾[4]中也有報道。本研究中，當輻射劑量分別為50MDA 含量的高低可以作為植株個體受外界脅迫大小的衡量標準。當植株受到外界脅迫時，植株體內會出現膜脂過氧化作用，產生導致植株某些部位受損的膜質過氧化產物MDA，從而改變植株脂質過氧化的速度和強弱，其含量與植物受損程度呈正相關關系[18]。本研究中，隨著輻射劑量的上升，MDA含量表現出先升高后降低的趨勢，各處理的MDA含量均高于對照，在150 Gy 處理下MDA 含量達到最大值，說明不同劑量60Co-γ 射線處理均對扁穗雀麥幼苗造成了膜質過氧化損傷，致使機體活性氧與自由基積累增加，從而導致膜結構的完整性被破壞，且在150 Gy 輻射劑量下破壞程度最大，類似結果在白刺花(Sophora davidii)[19]和高羊茅(Festuca elata)[20]等飼用植物中也有報道。在200 Gy 下，MDA 含量有所降低，這也許是由于高輻射劑量(200 Gy)加強了植物體內某些修復酶活性，膜脂過氧化受到抑制，從而降低了植物受損的程度。Pro作為滲透調節物質，能夠增加細胞液濃度、降低滲透勢，從而增加植物對水分的吸收，同時能夠提高細胞膜的穩定性，從而在植物受到輻射或其他逆境脅迫時發揮重要作用[21]。本研究中，隨著輻射劑量的上升，Pro含量表現出先上升后下降的趨勢，表明中低輻射劑量下脯氨酸的積累對幼苗有一定的保護作用，而高劑量輻射下由于生理系統被強烈破壞導致脯氨酸含量下降。在繡球(Hydrangea macrophylla)[22]和無芒雀麥[23]的研究結果中也有類似情況。SOD作為一種保護酶，可以減少或消除超氧自由基對細胞膜的損害，其活力大小可以作為衡量植物抗氧化能力強弱的指標，屬于植物體內保護酶的組成成分之一[24]。CAT 屬于一種清除性酶類，具有抑制植物受H2O2毒害的作用，因為其可以促進H2O2分解為水和氧離子[25]。本研究中，隨著輻射劑量的上升，SOD與CAT 活性均表現出先升高后降低的趨勢，類似結果在露地菊(Chrysanthemum morifolium)[26]和草地早熟禾[4]中也有報道。本研究中，當輻射劑量分別為50和150 Gy 時，幼苗SOD和CAT活性最強，隨后有所下降，這可能是由于低劑量未導致CAT 與SOD酶活性系統受到損傷，可以消除機體內過多積累的氧化性物質，有助于植株體內一些修復酶活性的提升，從而能夠抵御各種脅迫環境；而當輻射劑量過高時，幼苗體內累積過多的過氧化物及自由基，造成一系列膜透性損傷，導致SOD與CAT 活性下降。

Chl 是與光合效應有關的色素之一，是植株進行能量及物質代謝的基本物質，同時可以反映在不利環境下植株的受損程度[27]。本研究中，扁穗雀麥種子受到60Co-γ 射線輻射后，葉片的Chl a、Chl b和總Chl 含量先隨輻射劑量的增加而增加，當輻射劑量上升到50 Gy 時，Chl a、Chl b和總Chl 含量均達到最大值，此時可能是由于扁穗雀麥葉片為了提高自身的光合速率而增加葉綠素含量，以抵御逆境脅迫的危害，這有助于葉片的光合效應，對植株生長產生一定的促進作用。而在輻射劑量為100～200 Gy下，其含量均低于對照，可能是由于60Co-γ 射線輻射扁穗雀麥種子破壞了葉綠體的結構，使葉綠素含量降低，從而影響植株的生長。這與使用60Co-γ 射線對紫薇(Lagerstroemia indica)[28]輻射后使葉片葉綠素含量呈先升高后下降趨勢的研究結果一致。而在對露地菊[26]的研究中發現，其變化趨勢為先下降后上升，這與本研究結果不同，可能是由于各個植株對60Co-γ 射線的敏感度不一致所致。

本研究利用60Co-γ 射線對扁穗雀麥種子進行輻照處理，當輻射劑量為50和100 Gy 時，在種子萌發、幼苗生長、減輕膜質過氧化程度、維持細胞滲透勢以及加快消除自由基等方面表現最優。經推算，60Co-γ 輻射扁穗雀麥種子的半致死劑量為224 Gy。上述結果對于創制扁穗雀麥新種質提供了一定的技術支撐和理論參考。