不同凡納濱對蝦養殖群體的微衛星遺傳多樣性分析

唐芳 溫貝妮 劉紅

摘要：【目的】明確不同凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）養殖群體間的遺傳信息豐富度和遺傳分化程度，為構建適應上海獨特氣候對蝦品種繁育計劃中的交配系譜分析提供參考依據?！痉椒ā窟x用13對微衛星引物對來自厄瓜多爾恒興對蝦養殖公司2個養殖場（Pesquera和San Alfonso）共9個凡納濱對蝦養殖群體進行遺傳多樣性分析，探究不同群體間的遺傳信息豐富度和遺傳分化程度?！窘Y果】13個微衛星位點在9個凡納濱對蝦養殖群體中檢測到的等位基因數（Na）為2～6個，共有37個等位基因，多態信息含量（PIC）為0.1292～0.6799，平均為0.3326。在13個微衛星位點中，僅有1個微衛星位點（TUMXLV9.116）呈高度多態性，有4個微衛星位點（TUMXLV10.147、TUMXLV5.45c、TUMXLV10.191c和TUMXLV10.96）呈低度多態性，其余8個微衛星位點呈中度多態性。9個凡納濱對蝦養殖群體的觀測雜合度（Ho）為0.2225～0.3662，平均為0.2915;期望雜合度（He）為0.3317～0.4539，平均為0.3974;Hardy-Weinberg平衡指數（D）為0.0214～0.4214，其中San Alfonso P23群體和Pesquera P23群體的D相對更接近于0，其基因型分布接近于Hardy-Weinberg平衡狀態。9個凡納濱對蝦養殖群體的Fst平均值為0.1259，說明有12.59%的遺傳分化來源于群體間，而87.41%的遺傳分化來自群體內部;群體間的平均基因流（Nm）為1.7356，表明遺傳漂變未能主導種群遺傳結構的變化。在9個凡納濱對蝦養殖群體間，以Pesquera 29群體與Pesquera 15群體的遺傳距離最大（0.2426），San Alfonso 23群體與Pesquera 23群體的遺傳距離最小（0.0215）;基于遺傳距離的UPGMA聚類分析結果表明，9個凡納濱對蝦養殖群體可分為兩大類，其中Pesquera 29群體和San Alfonso 12群體獨立聚為一類?！窘Y論】在9個凡納濱對蝦養殖群體中存在觀測等位基因丟失現象，且遺傳多樣性較低，群體間分化程度為中等水平。因此，可通過引進不同地區擁有不同遺傳背景且親緣關系較遠的群體作為親本，以豐富子代群體的遺傳多樣性。

關鍵詞： 凡納濱對蝦;養殖群體;微衛星分子標記;遺傳多樣性;遺傳分化

中圖分類號： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）04-1108-08

Microsatellite genetic diversity in different Litopenaeus

vannamei breeding populations

TANG Fang， WEN Bei-ni， LIU Hong*

（College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University/Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources Exploration and Utilization of Ministry of Education， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】To provide reference for mating and pedigree analysis in the breeding plan that the species in this research group could adapt to Shanghais unique climate， genetic information abundance and the degree of genetic differentiation among different Litopenaeus vannamei breeding populations were clarified. 【Method】Thirteen pairs of microsatellite primers were used to analyze the genetic diversity of nine L. vannamei breeding populations，which came from two farms（Pesquera and San Alfonso） of the L. vannamei breeding company in Ecuador. It could also explore the richness of genetic information and differentiation among different populations. 【Result】The number of alleles（Na） detected among nine L. vannamei breeding populations by 13 microsatellite loci ranged from 2 to 6， there were 37 alleles. Polymorphism information content index（PIC） was between 0.1292 and 0.6799， and the average PIC was 0.3326. Among the 13 microsatellite loci，only 1 microsatellite loci（TUMXLV9.116） had highly polymorphic，another 4 microsatellite loci（TUMXLV10.147， TUMXLV5.45c， TUMXLV10.191c and TUMXLV10.96） showed low polymorphism，and the remaining 8 microsatellite loci were moderately polymorphism. Otherwise， the observed heterozygosity（Ho） of 9 populations ranged from 0.2225 to 0.3662， and the average Ho was 0.2915. Expected heterozygosity（He）ranged from 0.3317 to 0.4539， and the average He was 0.3974. Hardy-Weinberg balance index（D） was ranging from 0.0214 to 0.4214. Among which the D of the San Alfonso P23 population and the Pesquera P23 population were relatively closer to 0， and their geno-type distribution was close to the Hardy-Weinberg balance state. The numerical valueof mean differentiation index（Fst） was 0.1259， indicating that there was 12.59% of genetic differentiation took place between the populations， and 87.41% of genetic differentiation occurred within the populations. Besides， the mean gene flow（Nm） between populations was 1.7356， indicating that genetic drift had not been able to dominate the change of population genetic structure. Among the 9 L. vannamei breeding populations， the genetic distance between Pesquera 29 and Pesquera 15 was the largest （0.2426）， and the genetic distance between San Alfonso 23 and Pesquera 23 was the smallest（0.0215）. According to the UPGMA clustering based on genetic distance， the 9 L. vannamei populations could be divided into two major groups， among which the Pesquera 29 population and the San Alfonso 12 population were grouped independently into one group. 【Conclusion】In the 9 breeding populations， lost observed allelic genes occurs， and they have low genetic diversity and mode-rate degree of differentiation among populations. It is possible to enrich the diversity of off spring populations by introdu-cing populations from different regions with different genetic backgrounds and long genetic distance as parents.

Key words： Litopenaeus vannamei; breeding populations; microsatellite molecular marker; genetic diversity; genetic differentiation

Foundation item： Shanghai Science and Technology Promoting Agriculture Project（2019-02-08-00-F01111）

0 引言

【研究意義】凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，是我國重要的養殖對蝦品種，但近年來其經濟性狀明顯衰退且病害頻發（蔣葛等，2019），嚴重限制了凡納濱對蝦養殖產業的持續健康發展（包秀鳳，2014;彭敏等，2020）。培育抗逆性強且生長快的優良對蝦養殖品種，是確保凡納濱對蝦養殖業健康發展的重要保障（楊銘等，2017）。國外學者針對凡納濱對蝦的存活率、生長性能、抗病毒等性狀已開展了一系列良種選育工作（Benzie et al.，1997;Argue et al.，2002;Gitterle et al.，2005）;我國也選育出中興1號、壬海1號、海興農2號等生長速度快、存活率高、可高密度養殖的凡納濱對蝦品種（唐揚等，2018），但能大規模應用到實際生產的品種不多。本課題組多年來一直致力于開展耐低鹽、能適應上海當地氣候條件的凡納濱對蝦良種品系選育工作，現已完成F3代選育工作。為了更合理地利用這一種質資源，高質量開展良種選育工作，因此非常有必要對其種質資源進行遺傳背景分析。【前人研究進展】微衛星（Microsatellites）又稱為簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR），是由2～6個堿基組成基序（motif）串聯重復而形成的DNA序列（馬寧和曾地剛，2013），具有共顯性和多態性，且穩定性較好，現已廣泛應用于生物群體間的遺傳關系研究。Jerry等（2004）通過模擬和控制交配以開發日本對蝦微衛星分子標記，并證實其在后代指定親本方面的潛力，即微衛星分子標記可作為親緣關系鑒定中的保留系譜信息。劉海情等（2012）利用微衛星分子標記分析廣東省化州光輝養殖場有限公司新選育的吉富羅非魚第16代群體（F16）的遺傳多樣性，證實該吉富羅非魚群體具有較高的遺傳異質性和較大的選育空間，可作為下一步選育工作的基礎選育群體。魯翠云等（2015）通過構建鏡鯉全同胞家系的微衛星遺傳圖譜，最終篩選出83個優勢基因型。孫成飛等（2015）基于微衛星分子標記比較分析中國羅氏沼蝦和泰國羅氏沼蝦養殖群體的遺傳多樣性及遺傳結構，發現二者均具有較高的遺傳多樣性，但彼此親緣關系較遠。黃小芳等（2020）選取8個微衛星分子標記對廣西不同地區的克氏原螯蝦群體進行遺傳多樣性分析，結果顯示廣西不同地區的克氏原螯蝦群體雜合子缺失現象普遍存在，應通過適當引種及加強不同地區群體間的遺傳交流。近年來，凡納濱對蝦微衛星分子標記的開發和應用得到迅速發展（于洋，2014）。Meehan等（2003）最先公布了251個凡納濱對蝦微衛星序列，并篩選出93個具有多態性的微衛星引物，為凡納濱對蝦微衛星分子標記的開發奠定了基礎。Cruz等（2004）利用微衛星分子標記（Pvan1578和Pvan1815）監測2代凡納濱對蝦的遺傳多樣性，結果顯示在育種計劃中無明顯的遺傳變異性損失，但等位基因的可變性降低，建議通過不同品系雜交以增加種群的遺傳變異。謝麗等（2009）采用9對微衛星引物分析凡納濱對蝦4個選育群體（Molokai、OI、SIS和Kona Bay）的遺傳多樣性，結果顯示OI群體與Kona Bay群體的親緣關系最近，而SIS群體與Molokai群體的親緣關系最遠。李東宇等（2016）建立了一套微衛星多重PCR擴增體系并將其應用于凡納濱對蝦家系親權鑒定，其模擬配對率和親權鑒定準確率均為100%，尤其是全同胞和半同胞家系的鑒別效果良好。此外，王鴻霞等（2006）、劉洪濤等（2018）、方振朋等（2019）、黃小帥等（2019）、李強勇等（2020）也先后將微衛星分子標記應用于凡納濱對蝦的多態性分析及家系鑒定研究領域?！颈狙芯壳腥朦c】微衛星分子標記具有多態性高、穩定性好、經濟實惠、便于大批量分析等優點（楊銘等，2017），可用于監測育種方案中的群體遺傳力及遺傳變異水平。本課題組前期已培育出累計世代的自交和雜交群體，為了更好地繼續開展育種工作，亟需引進不同地區擁有不同遺傳背景且親緣關系較遠的群體作為親本?！緮M解決的關鍵問題】利用微衛星分子標記對來自厄瓜多爾恒興對蝦養殖公司2個養殖場（Pesquera和San Alfonso）共9個凡納濱對蝦養殖群體的遺傳背景進行分析，明確9個群體間的遺傳信息豐富度和遺傳分化程度，以期為構建適應上海獨特氣候對蝦品種繁育計劃中的交配系譜分析提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

凡納濱對蝦樣品來自恒興對蝦養殖公司在厄瓜多爾的2個養殖場（Pesquera和San Alfonso），共9個養殖群體，其幼體來源于Texcumar公司，親本均為泥塘養殖群體，每個群體選取30尾活蝦，采集其肌肉組織置于無水乙醇中，-20 ℃保存備用。9個凡納濱對蝦養殖群體的親本信息見表1。

1. 2 總DNA提取

采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取凡納濱對蝦組織DNA，以Eppendorf分光光度計測定DNA濃度及OD值，并使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶完整性;最后用TE溶液稀釋至100 ng/μL，4 ℃保存備用。

1. 3 微衛星引物篩選與合成

選用的13對微衛星引物由本課題組成員張海強于2015年篩選獲得，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。微衛星引物序列見表2。

1. 4 PCR擴增及電泳分析

PCR反應體系20.0 μL：2×Taq PCR MasterMix[生工生物工程（上海）股份有限公司]10.0 μL，DNA模板終濃度為10 ng/μL，上、下游引物各1.0 μL，加ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性4 min;94 ℃ 30 s，50～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行38個循環;94 ℃ 40 s，45 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，進行13個循環;72 ℃延伸5 min。采用8% SDS-PAGE進行分型，硝酸銀染色，觀察拍照。

1. 5 統計分析

獲得9個凡納濱對蝦養殖群體的基因分型數據后，采用PopGene32計算群體的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei?s多樣性指數（H）及Hardy-Weinberg平衡指數（D）等群體遺傳學參數（Yeh and Boyle，1997）;使用Cervus 3.0計算微衛星位點的多態信息含量（PIC）;參照Nei（1978）的無偏向性方法（Unbiased measures）計算群體間的遺傳距離和遺傳相似系數;并根據9個凡納濱對蝦養殖群體的遺傳距離，采用MEGA 5.0進行UPGMA聚類分析。

2 結果與分析

2. 1 凡納濱對蝦微衛星位點擴增結果

13對微衛星引物均能從凡納濱對蝦組織中穩定擴增出相應的條帶，從9個凡納濱對蝦養殖群體中共檢測獲得37個等位基因，且等位基因大小主要集中在150～260 bp。微衛星引物TUMXLV10.41在Pesquera 23群體中的PCR擴增產物經8% SDS-PAGE分型，可觀察到單一（純合）或2條（雜合）目的擴增條帶（圖1）。

2. 2 凡納濱對蝦微衛星位點遺傳多樣性分析結果

13個微衛星位點在9個凡納濱對蝦養殖群體中的遺傳參數見表3。其中，Na為2～6個，平均為2.8462個;Ne的范圍在1.2074～4.6310個，平均為2.0269個，Ho的范圍在0.0171～0.5977，平均為0.2922;He的范圍在0.1453～0.7856，平均為0.4412;PIC的范圍在0.1292～0.6799，平均為0.3326。依據Botstein等（1980）的判斷標準：PIC<0.25代表該位點呈低度多態性，0.25≤PIC≤0.50代表該位點呈中度多態性，PIC>0.50代表該位點呈高度多態性。在13個微衛星位點中，僅有1個微衛星位點（TUMXLV9.116）呈高度多態性，有4個微衛星位點（TUMXLV10.147、TUMXLV5.45c、TUMXLV10.191c和TUMXLV10.96）呈低度多態性，其余8個微衛星位點則呈中度多態性。

9個凡納濱對蝦養殖群體在13個微衛星位點上的遺傳參數見表4。其中，Ne的范圍在1.6341～1.9992個，Ho的范圍在0.2225～0.3662，He的范圍在0.3317～0.4539。Pesquera 5群體的PIC最?。?.2772），San Alfonso 32群體的PIC最大（0.3573），9個凡納濱對蝦養殖群體的PIC均在0.25～0.50范圍內，表明這9個養殖群體的遺傳多態性均為中等水平。此外，凡納濱對蝦養殖群體的D范圍在0.0214～0.4214，均大于0，表明這9個凡納濱對蝦養殖群體的雜合子過剩，不同程度地偏離于Hardy-Weinberg平衡狀態。

2. 3 凡納濱對蝦群體遺傳分化分析結果

物種群體間的遺傳分化等級通常采用遺傳分化指數（Fst）和基因流（Nm）進行表示。由表5可知，有3個微衛星位點的Fst在0～0.05范圍內，分別是TUMXLV10.147、TUMXLV8.2c和TUMXLV6.124，表明凡納濱對蝦群體在這3個微衛星位點上的遺傳分化很小，可忽略不計;有2個微衛星位點（TUMXLV 10.191c和TUMXLV10.96）的Fst均大于0.25，表明凡納濱對蝦群體在這2個微衛星位點上存在明顯的遺傳分化;其余8個微衛星位點的Fst在0.05～0.15范圍內，則表明凡納濱對蝦群體在這8個微衛星位點上存在中等程度的遺傳分化。9個凡納濱對蝦養殖群體的Fst平均值為0.1259，說明有12.59%的遺傳分化來源于群體間，而87.41%的遺傳分化來自群體內部。由于Nm與Fst呈負相關，因此二者反映的群體遺傳分化結果具有趨同性。在13個微衛星位點中，有3個微衛星位點（TUMXLV10.147、TUMXLV8.2c和TUMXLV6.124）的Nm>4.000，有2個微衛星位點（TUMXLV10.191c和TUMXLV10.96）的Nm<1.000，其余8個微衛星位點的Nm則介于1.000～4.000。

由表6可知，在9個凡納濱對蝦養殖群體間，以Pesquera 29群體與Pesquera 15群體的遺傳距離最大（0.2426），而San Alfonso 23群體與Pesquera 23群體的遺傳距離最?。?.0215）。在遺傳相似性系數方面則表現為：Pesquera 29群體與Pesquera 15群體的遺傳相似系數最?。?.7846），San Alfonso 23群體與Pesquera 23群體的遺傳相似系數最大（0.9787）?？梢?，凡納濱對蝦養殖群體間的遺傳相似性系數與遺傳距離呈線性負相關?；?個凡納濱對蝦養殖群體的遺傳距離，采用MEGA 5.0進行UPGMA聚類分析，以直觀呈現9個凡納濱對蝦養殖群體間的親緣關系。如圖2所示，9個凡納濱對蝦養殖群體可分為兩大類（I類和II類），其中Pesquera 29群體和San Alfonso 12群體獨立聚為I類。在II類中，Pesquera 15群體單獨作為一支，San Alfonso 32群體和Pesquera 5群體聚為一支，其余4個養殖群體則聚為另一支。

3 討論

3. 1 凡納濱對蝦的遺傳多樣性

本研究結果表明，從9個凡納濱對蝦養殖群體的13個微衛星位點共檢測到37個等位基因，Na為2～6個，與張海強（2015）檢測到Na為3～5個的結論存在差異，可能是近交繁殖導致這9個凡納濱對蝦養殖群體連續世代中存在觀測等位基因丟失現象。等位基因較多的位點傾向于具有較高的等位基因分布值，因此所含信息量更大，更適用于養殖對蝦遺傳變異檢測。PIC反映某個遺傳標記多態性可提供的信息量。在本研究中，13個微衛星位點的PIC為0.1292～0.6799，平均為0.3326，略低于Meehan等（2003）研究得到的PIC（0.195～0.873），可能是在凡納濱對蝦育種過程中存在復雜的人為干擾，而對其種群的遺傳信息量產生影響。此外，9個凡納濱對蝦養殖群體在13個微衛星位點上的Ho為0.2225～0.3622，平均為0.2915，低于Perez-Enriquez等（2009）、de Lima等（2010）檢測凡納濱對蝦養殖群體獲得的Ho（0.48～0.60和0.464～0.498）。說明本研究中的9個凡納濱對蝦養殖群體遺傳多樣性較低，究其原因可能是引進親本數量較少，零等位基因的存在減少了樣本量，或其親本使用了起源不確定的雜交種。因此，今后應盡可能在較大范圍內引進不同地區的親本來繁育后代，并完善親本遺傳背景分析，以保證子代處于較高的雜合水平。

Hardy-Weinberg平衡指數（D）表征Ho與He的平衡關系。D為正值表示雜合子過剩，D為負值則表示處于雜合子缺失狀態;D越接近于0，表明其基因型分布越接近于Hardy-Weinberg平衡狀態（謝麗等，2009）。在本研究的9個凡納濱對蝦養殖群體中，San Alfonso P23群體和Pesquera P23群體的D分別為0.0214和0.0376，相對更接近于0，說明其基因型分布接近于Hardy-Weinberg平衡狀態，另外7個群體則明顯偏離于Hardy-Weinberg平衡狀態。究其原因可能是人工選擇或組合交配育種過程中，凡納濱對蝦親本數量偏少，即子代群體是由少量親本組合雜交獲得，子代群體等位基因數量也相對減少，進而導致偏離Hardy-Weinberg平衡狀態及遺傳漂變（趙志英等，2018）。

3. 2 凡納濱對蝦的遺傳距離和遺傳分化

Fst是反映群體間遺傳分化程度的一個重要參數。本研究中，9個凡納濱對蝦養殖群體的平均Fst為0.1259，說明有12.59%的遺傳分化來源于群體間，而87.41%的遺傳分化來自群體內部，群體間的分化程度為中等水平。Hamrick等（1995）研究認為，Nm>1.000時能抵消遺傳漂變作用，阻止種群間發生分化;Nm<1.000時，遺傳漂變能主導種群遺傳結構變化。本研究結果表明，9個凡納濱對蝦養殖群體間的平均Nm為1.7356，即遺傳漂變未能主導種群遺傳結構的變化，各群體間的遺傳性趨向同一化，群體間的分化指數變小。Crawford和Littlepohn（1998）指出分化時間是影響群體間變異的主要決定因素，而遺傳距離能客觀反映群體間的分化時間及遺傳變異。在9個凡納濱對蝦養殖群體中檢測到的最大遺傳距離為0.2426、最小遺傳距離為0.0215，與Andriantahina等（2015）報道的最大遺傳距離（0.481）和最小遺傳距離（0.098）存在明顯差異?，F代雜種優勢理論認為，子代的雜種優勢與親本間的遺傳變異呈正相關（馮娜娜等，2012），因此在凡納濱對蝦人工繁育過程中，應選擇遺傳距離較遠群體中具有優良性狀的個體作為親本，進行良種選育和親本擴繁。

4 結論

在9個凡納濱對蝦養殖群體中存在觀測等位基因丟失現象，且遺傳多樣性較低，群體間分化程度為中等水平。因此，可通過引進不同地區擁有不同遺傳背景且親緣關系較遠的群體作為親本，以豐富子代群體的遺傳多樣性。

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（責任編輯 蘭宗寶）