單分子表面增強拉曼散射的光譜特性及分析方法*

趙星 郝祺2)? 倪振華 邱騰

1) (東南大學物理學院, 南京 211189)

2) (東南大學量子信息中心, 南京 211189)

單分子檢測代表分子檢測靈敏度的極限, 能夠提供傳統檢測方式無法提供的物理信息, 在化學分析、分子動力學機理、蛋白質解析等領域具有廣闊的應用前景, 具有重要的科學研究價值.具體而言, 單分子檢測能對復雜體系中的分子進行識別和計數, 給出分子的分布信息; 也可以對單個分子在吸附、反應等過程中的實時衍變進行追蹤, 研究分子動力學的內在機制.單分子表面增強拉曼散射是單分子檢測領域最近興起的一門新方法, 其特色在于具有特異性分子識別能力, 可以提供分子成鍵變化等動態信息.這種方法適用于研究分子的演化過程、分子與環境的電荷相互作用, 從而揭示分子的反應途徑、分布狀態、吸附方式、電荷交換等重要信息.單分子表面增強拉曼散射的概念提出較早, 但是缺乏高效的采集方法和精確的判定依據, 本文將對采集方法的優化進行梳理分析, 從非統計學和統計學兩個角度對其進行討論, 并重點對雙分子分析檢測法做詳細介紹.另一方面, 由于單分子表面增強拉曼散射研究涉及各種交叉學科、內涵廣泛, 相關研究需要對光譜背后的相關機制有深刻的理解和認識.為此, 本文基于當前的相關研究工作, 從分子漂移、光譜閃爍及展寬等特有現象入手, 分析了單分子表面增強拉曼散射的波動特征及其對應的物理機制, 并對其應用前景做了簡要探討.

1 單分子SERS的發展歷程

表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)技術是一種無損的分子檢測技術, 它反映了分子鍵振動能量和轉動能量信息,是一種能夠對分子進行特異性識別的“指紋”光譜,被廣泛用于定量分析、傳感檢測、催化、生物及能源等研究領域[1?11].通常情況下普通分子的拉曼信號強度很低, 需要通過貴金屬納米材料對其進行增強來實現高靈敏度的分子檢測, 即“表面增強技術”.“表面增強技術”通常使用金、銀、銅等貴金屬材料, 這些材料的納米顆粒在激發光的照射下, 會在表面產生集體電子振蕩, 即表面等離激元振蕩(surface plasmons resonance, SPR)模式, 該模式可以突破光的衍射極限, 將激發光轉換為束縛于貴金屬材料表面幾個納米空間的局域電磁場(“熱點”)[12,13].這種局域電磁場強度極高, 可以將入射光能量匯聚在狹小的納米空間之內, 從而放大附近探針分子的拉曼光譜信號, 即電磁場增強拉曼散射[14].與此同時, 貴金屬材料中被激發的熱電子與分子的最高占據軌道(highest occupied molecular orbital, HOMO)和最低未占據軌道(lower unoccupied molecular orbital, LOMO)之間會發生電荷轉移, 導致分子的極化率增加, 形成化學增強拉曼散射[15?18].由于這兩種增強方式往往同時存在和產生作用, 被統稱為SERS技術.與傳統的拉曼光譜相比, SERS技術能夠顯著增強分子的拉曼信號(高達1014甚至更大)[15], 從而實現痕量乃至單分子級別的分子檢測[19,20].

單 分 子SERS (single-molecule SERS, SMSERS)是指在光斑內處于熱點附近的單個探針分子所發出的拉曼光譜.與傳統的拉曼光譜相比,SM-SERS不再是大量分子集合信號的平均, 而是能夠提供分子的空間狀態和所處環境的特異性光譜, 因此具有較窄的半高寬和更高的質量因子, 如圖1所示[21].SM-SERS能夠反映分子的各異性,從而獲得分子的吸附狀態、動力學規律及化學反應演化過程等重要信息[22], 可以在單分子水平上觀察到納米級尺度環境中單個分子的靜態和動態事件, 具有重要的科學研究價值.

圖1 SM-SERS與普通SERS光譜圖的區別[21]Fig.1.Typical spectra of SM-SERS and traditional SERS[21].

SM-SERS在1997年首先由聶書明等[23]和Kneipp等[24]提出.他們在銀膠溶液體系中分別觀察到了超低濃度(10–11mol/L)羅丹明6G (Rhodamine 6G, Rh6G)分 子 和(10–14mol/L)結 晶 紫(Crystal violet, CV)分子的類SM-SERS信號.這種方法認為超低的分子濃度(亞納摩級)實現的光譜學測量可近似地認為是單分子測量, 是早期SMSERS研究的主要方法[25?28].基于這種方法, 徐紅星院士[26]對聚合的銀納米顆粒體系進行研究, 發現SM-SERS僅存在于由兩個或多個金屬納米顆粒構成的體系中, 而在單個金屬顆粒上難以實現,因此提出金屬納米間隙之間的超強局域電磁場是實現SM-SERS的必要條件.這類方法, 我們稱之為超低濃度檢測法, 使用起來相對比較簡單方便,但是在對SM-SERS的認定上存在一定瑕疵, 因為分子在低濃度(單分子水平)體系中服從泊松分布,SM-SERS光譜的獲取存在很大的隨機性, 因此檢測效率較低且難以區分單分子光譜與多分子光譜[22].針對以上問題, Le Ru等[29]在2006年提出雙分子分析技術用于SM-SERS檢測, 從統計學的角度有效地區分了單分子光譜與多分子光譜.這種方法現在被普遍認為是獲得SM-SERS光譜的標準方法, 我們將在后文中對此進行詳細介紹.

隨著納米技術和生物科技的發展, 研究人員也開始在更多的體系中進行SM-SERS研究, 例如在SPR材料表面引入帶有單個染料分子的DNA用于構造“間隙”結構來實現具有高確定度的SMSERS檢測[30,31], 如圖2(a)所示, 或者將拉曼光譜儀與掃描探針顯微鏡等表征儀器結合來實現具有極高空間分辨率和單分子級別靈敏度的針尖增強拉曼散射光譜(tip-enhanced Raman spectroscopy,TERS)[32], 并用于SM-SERS檢測等相關工作[33?38].在先前研究工作中TERS成像的空間分辨率大約只局限于3—15 nm[39], 這種較低分辨率不足以解析和研究單個分子的物理化學信息.2013年中國科學技術大學的董振超教授團隊[33]利用掃描隧道顯微鏡并結合高強局域電磁場的針尖基底觀察到了亞納米級(空間分辨率為0.5 nm)單個靶分子不同振動模式的TERS成像, 如圖2(b)和2(c)所示.該工作在國際上首次實現亞納米級高分辨率單個分子的拉曼光譜成像, 使得研究單個分子在亞納米空間中的分布狀態及其物理化學信息成為可能.隨后該研究團隊利用這項技術在亞納米級分別研究了相鄰分子間的區分(如圖2(d)所示), 以及相干分子間激子耦合的成像觀察, 這些工作為研究分子間的相互作用、能量轉移、分子吸附取向(如圖2(e)所示)、DNA測序(如圖2(f)所示)及蛋白質檢測等提供了單分子水平的分析方法[34?38].

圖2 (a) DNA在修飾的金@銀納米粒子殼層結構之間構造“間隙”結構用于SM-SERS檢測[30]; (b)掃描隧道顯微鏡控制的TERS的示意圖, 其中Vb是偏置電壓, It是隧道電流[33]; (c)高分辨靶分子TERS光譜與圖像[33]; (d)相鄰分子間的TERS成像(上)及沿圖中軌跡線進行十次連續TERS測量的相應光譜演化(下)[34]; (e)分子亞納米分辨率STM圖像(左)以及單個分子偶極矩模擬計算圖(右)[36]; (f) DNA單鏈片段的TERS圖像[38]Fig.2.(a) The Gap structure constructed by DNA modified gold@silver nanoparticles for SM SERS detection[30]; (b) schematic diagram of TERS controlled by scanning tunneling microscope, where Vb is the sampling bias voltage and It is the tunnel current[33];(c) high-resolution TERS spectrums and images of target molecules[33]; (d) TERS imaging between adjacent molecules (up) and the corresponding spectral evolution of ten consecutive TERS measurements along the trajectory in the left image (down)[34]; (e) molecular sub-nanometer resolution STM image (left) and single molecule dipole moment simulation calculation diagram (right)[36];(f) TERS image of DNA single-stranded fragments[38].

在上述的研究中, 除了討論如何獲取SM-SERS信號之外, 研究人員還發現SM-SERS信號隨時間波動等不同于普通SERS光譜的實驗結果, 并認為信號波動現象是驗證SM-SERS的實驗證據之一,然而在后續的研究中發現在多分子或其他體系中也存在該現象[22,40].雖然光譜信號波動不是一種嚴格證明SM-SERS的方法, 但是SM-SERS中的光譜波動卻能夠提供分子細微的SERS光譜, 并揭示出分子在“熱點”區域的分布狀態及在襯底表面的吸附方式等微觀系統中的行為特征, 具有重要的研究意義.當前SM-SERS的發展仍處于初級階段,如何獲取可靠穩定的SM-SERS光譜, 以及理解SMSERS光譜波動背后的理論機制是目前研究的核心方向.基于此, 本文將針對用統計學和非統計學方法獲取SM-SERS的技術進行介紹, 并對SM-SERS光譜的特性及可能的理論機理進行闡述和分析.最后, 本文就目前的研究工作提出了SM-SERS面臨的挑戰及未來努力的方向, 希望能為今后SMSERS研究工作的開展起到一個拋磚引玉的作用.

2 單分子SERS光譜的采集

上文已經提到, 使用超低濃度檢測法的非統計學方法來獲取單分子光譜事件是獲取SM-SERS信號一種常見且簡易的方法.該方法一方面稀釋靶分子濃度以保證在平均意義上的探測體積內存在一個甚至更少的分子, 另一方面需要優化基底的結構、形貌, 以及選擇合適的激發波長來實現高增強因子(enhancement factor, EF)的SERS增強.聶書明等[23]和Kneipp等[24]認為較低的分子濃度和1014以上的增強因子(enhancement factor, EF)是獲得SM-SERS信號的關鍵.一般認為, SERS的EF來源于電磁增強和化學增強兩部分[41].但除了上述兩種主要的增強機制外, 分子與基底接觸后, 與自由態分子相比, 其軌道能級發生雜化.當激發光的光子能量與分子HOMO和LOMO軌道之間的能級差匹配時, 形成共振增強拉曼散射(resonance-enhanced Raman spectroscopy, RERS).該現象也是SERS中必須要考慮到的增強因素, 特別是在SM-SERS研究中, 這種增強的貢獻是不容忽略的.雖然RERS只能提供大約102—106倍的增強效果[22], 并且從理論上來說其較低的EF很難單獨用于采集SM-SERS信號, 但是它與電磁場和化學增強的協同作用有助進一步提高靶分子的拉曼信號, 從而使SM-SERS信號采集更加穩健可靠.基于此, Habuchi等[42]利用488 nm激光在銀膠體系中觀察到了單分子級別綠色熒光蛋白分子的拉曼信號.除了局域電磁場的貢獻之外, 作者認為RERS也有助于SM-SERS檢測.在后續的研究中Blackie等[43]發現不同散射截面探針分子實現SM-SERS需要的EF有較大區別.對于散射截面比較大的共振探針分子(10–27—10–28cm2/sr), 考慮到化學增強和RERS的貢獻, “熱點”處的電磁場增強EF需達到108以上, 如圖3所示; 對于散k射截面比較小的非共振分子(10–29—10–30cm2/sr)而言, 電磁增強EF至少在1010以上才能獲得SMSERS信號[43].

圖3 不同散射截面分子實現SM-SERS檢測所要滿足的電磁增強EF[43]Fig.3.Electromagnetic enhancement EF value of molecules with different cross sections required for SM-SERS detection[43].

這種使用超低濃度檢測方法被廣泛運用于早期SM-SERS的采集以及研究催化反應動力學中反應物分子之間的相互作用及化學反應的本質.例如: Zhang等[44]利用金納米顆粒二聚體觀察到了4-硝基苯硫酚(4-Nitrothiophenol, 4-NTP)的光裂解現象, 揭示了硫酚分子的生成反應途徑, 如圖4(a)所示, 為后續研究單分子4-NTP催化反應動力學提供了理論依據和實驗支撐; 廈門大學李劍峰團隊[45]在納米腔中研究了單個羅丹明B異硫氰酸酯分子的催化反應過程, 如圖4(b)所示, 該研究利用光譜閃爍等SM-SERS特性將SERS信號與分子的熒光聯系起來, 揭示了納米甚至亞納米級別的微觀系統中單個分子的化學反應行為與宏觀反應的區別.

圖4 SM-SERS技術用于監測原位催化反應過程 (a) 單個4-NTP分子通過原位催化反應生成硫酚分子的SERS光譜圖[44];(b)單分子羅丹明B異硫氰酸酯經歷不同光照時間催化生成不同物質所對應的光譜圖[45]Fig.4.Monitoring in situ catalytic reaction via SM-SERS: (a) SERS spectra of Thiophenol generated by single-molecule 4-NTP via in situ catalytic reaction[44]; (b) SERS Spectra of Rhodamine B isothiocyanate catalyzed by single-molecule rhodamine B under different illumination time[45].

上述工作大多近似地認為在低濃度條件下可以獲得SM-SERS信號, 并認為其觀察到的SERS光譜波動現象可以作為確認SM-SERS的實驗依據.然而在低濃度條件下, 分子落在熱點區域內的概率非常低, 因此有大量的區域無法觀察到任何信號, 導致SERS信號有很大的隨機性.另外, 通過光譜波動確定SM-SERS事件也不嚴謹, 因為在多分子事件或者其他事件中也可以觀察到類似現象[46,47].綜合而言, 這類方法無法嚴格甄別單分子光譜和少分子光譜的區別, 由此得到的物理機制難免有一定瑕疵; 但這類方法為研究單分子或少分子體系SERS提供了一種簡捷的途徑, 特別是在動態化學反應檢測中能夠給予快速的信號反饋, 為分析和尋找反應中間產物提供了有效方法.

另一種獲取SM-SERS的方法主要從統計學角度出發來確保獲得的光譜為單分子光譜.Le Ru等[48]發現, 處于高濃度探針分子溶液中的金屬納米結構表面吸附的分子數目服從高斯分布, 而超低濃度探針分子環境中與金屬結合的分子數目服從泊松分布.對泊松分布的數據進行科學分析要求SERS事件之間的強度變化小于2倍, 并且還要采集10000組以上有效數據, 這使得嚴謹的SM-SERS很難實現[22].為此Le Ru[29]等提出使用雙分子分析測量法: 同時對兩種不同的分子進行SERS檢測, 并在結果中尋找只有單個分子光譜的獨立事件.在高濃度樣品中由于存在大量的分子, SERS信號原則上應該是兩種分析物的混合光譜.然而在單分子水平中, 熱點區域內只有少量分子存在,測量獲取的SERS光譜會出現只有單個分析物SERS光譜的獨立事件.但是從統計學角度來講, 利用雙分子分析測量法獲得SM-SERS信號選用的樣品濃度較高時, 獲得SERS光譜為單分子事件的概率更高.這是因為采集光譜時會出現混合及純A(或純B)光譜事件, 混合光譜顯然為多個分子(一個以上的分子)事件, 而純A(或純B)光譜事件可能源于兩種情況: 1)檢測區域內所有分子都是同一種分子; 2)或者檢測區域內有單個分子位于熱點區域, 掩蓋了其他分子的SERS光譜, 即我們所需要的單分子光譜.在分子濃度相對較高的情況下檢測區域包含的靶分子數目會增多(假設有N個),檢測區域內N個分子為同一種分子(純A或純B分子)的概率為(1/2)N, 因此該信號為單個分子光譜的概率為1–(1/2)N.在N較高時, 此概率接近于1, 因此可以大概率確定獲得的純A(或純B)光譜是單分子事件.這種方法從統計學角度更嚴謹地證實了SM-SERS的存在, 并被廣泛的使用.Mao等[49]通過物理沉積的手段獲得銀納米顆粒-金納米碗復合襯底, 通過模擬計算發現該結構具有強大的電磁場增強效果.基于雙分子分析方法在該基底表面成功獲得SM-SERS信號.實驗發現在采集了大量光譜后經過統計計算發現單個Rh6G分子事件與單個CV分子事件比例接近相同, 如圖5(a)所示.該結果與先前Etchegoin等[50]報道的單分子靈敏度比率相匹配.另一種與之類似的方法使用含有某種同位素的相同分子來代替兩個不同分子進行檢測, 從而保證了兩種分子具有完全相同的化學結合能和拉曼散射截面, 可以更準確地判斷SMSERS事件[51], 如圖5(b)所示.雙分子分析方法雖然沒有從實驗角度解決“熱點”不均勻分布及靶分子在“熱點”中有效吸附的問題, 但是從測量方法和統計學角度給出了獲取SM-SERS光譜的科學方法, 更加嚴謹地證實了SERS的單分子檢測能力.

圖5 雙分析物測量法獲取SM-SERS (a) Rh6G事件、CV事件和混合事件的SERS光譜圖(左)及三種事件的統計直方圖(右)[49]; (b)不同同位素標記Rh6G后獲得的三種不同獨立事件SERS光譜(左)及三種事件發生次數統計圖(右邊)[51]Fig.5.Typical SM-SERS spectra in bi-analyte measurements: (a) SERS spectra of an Rh6G event, CV event and mixed event(left), and statistical histograms of the three events (right)[49]; (b) SERS spectra of three different independent events (left), and statistics of the three events (right) by labelling Rh6G with different isotopes[51].

雙分子分析方法從統計學角度給出了獲取SM-SERS的方法, 然而在實驗中使用了較高的分子濃度, 導致大量分子吸附在無效區域, 無法充分發揮SERS的高靈敏度的優勢.因此SERS技術需要進一步對材料進行設計和優化, 降低對分子濃度的需求, 使SERS的檢測限能夠被真正地提高.對此相關學者提出了兩類不同的解決方案, 第一類方案先將分子分散在固體基底表面, 然后在分子位置構建“熱點”進行探測, 這樣能夠保證待測分子處于有效“熱點”區域, 從而獲得SM-SERS光譜.其中代表性技術為TERS[33,34], 納米腔體增強拉曼散射[52]及廈門大學的田中群院士團隊[53]提出的殼層隔絕納米顆粒增強拉曼散射.此類技術具有納米級甚至亞納米級別的空間分辨率, 增強能力較高,可以探測拉曼活性較低的分子, 適用于針對特定分子進行原位研究.而第二類工作的思路與上述方法相反, 先設計材料的“熱點”結構, 然后再將單個目標分子誘導至“熱點”區域.常見的方法是利用表面改性、DNA生物技術等方法對熱點區域進行修飾,然后將待測分子吸附或固定到“熱點”位置[30,54], 該方法不需要用到雙分子測量方法以及復雜的檢測設備, 在實用性和經濟性方面具有優勢, 其技術特點有利于發揮SM-SERS特異性檢測的優勢, 進一步拓寬SERS在DNA組裝[55]、蛋白質結構分析[56]及多相催化[57]等領域的應用.

3 單分子SERS的光譜特性與機理分析

早期研究階段, 科研人員在尋找單分子光譜過程中將SERS信號的劇烈波動視為SM-SERS的特征.光譜波動包括: 分子的漂移, 光譜的閃爍, 以及特定振動模式的相對強度變化等.后來經過研究證實在多分子或其他環境中也會出現類似的實驗現象[47].雖然這種獲得SM-SERS的方法缺少科學嚴謹性, 但是光譜波動也確是SM-SERS的一種特征性行為.研究SM-SERS光譜波動能夠從微觀的角度去理解單分子的物理化學性質, SERS的增強機理及光譜本身的一些現象, 使研究者能夠清楚地認識到化學反應的本質以及分子在微觀系統中的行為特性.在本節中我們將從分子的漂移[58,59]、光譜強度的閃爍[60,61]及光譜展寬[21,62]等方面[63,64]討論SM-SERS的光譜波動, 并結合相關研究報道對其中的物理機制做詳細地分析.

3.1 分子漂移

在SM-SERS研究中, 分子漂移指探針分子在熱點附近內外做無規則運動[65], 其主要原因可能是由于熱效應, 以及分子與襯底表面之間發生電荷轉移所導致[59,66,67], 而SERS中的電磁場增強是導致SERS光譜隨空間和時間變化的主要原因[22,68].如6圖所示的二聚體結構, 根據電磁場耦合理論二聚體納米結構在外場Eλ的作用下, 間隙中會產生強烈的局域電磁場Eloc(“熱點”), 而且隨著間隙的減小(間隙不小于0.5 nm)Eloc增強[69].考慮到單個分子在“熱點”附近內外做無規則運動以及相應光學理論, SM-SERS的信號ISM-SERS可以表示為[70]

其中,ωR和ω0分別表示單個分子偶極子的振蕩頻率以及激發光的頻率,α′表示拉曼張量,G(Ω)是拉曼張量α′經變換后的旋轉矩陣,Ω是探針分子的取向,rm表示分子與“熱點”中心處O(電磁場最強的區域)的距離.為了更好的理解分子漂移產生的SERS強度波動, 我們用圖6來解釋這一原因.當單個分子吸附在熱點區域內, 分子發生橫向漂移(rm變化)使分子位置發生幾個納米的變化從而導致分子SERS強度發生幾個量級的變化.

圖6 單個分子在熱點區域內發生漂移示意圖, 其中Eλ是入射光的電場, K ′ 表示波矢, O是“熱點”中心Fig.6.The schematic diagram of the diffusion of a singlemolecule in the hot spot area.Where Eλ is the electric field of the incident light, K ′ is the wave vector and O is the"hot spots" center.

Stranahan等[58]結合超分辨成像技術在銀二聚體中繪制出SERS質心的二維分布圖以及每個質心位置處的平均SERS強度.研究人員發現質心的運動是金屬表面單分子發生橫向漂移所導致的,并證明了單個Rh6G分子隨著時間的變化在熱點內外發生漂移, 如圖7所示.隨后該課題組利用SM-SERS同位素標記的分析物超分辨率成像揭示了SERS發射質心和相應強度之間的空間關系, 并以此說明了納米顆粒表面上的分子運動行為[71].該實驗結果有助于追蹤單個分子在SERS活性納米顆粒表面上的運動, 并且能夠繪制出圖像說明納米顆粒是如何實現局域電磁場增強的.此外, 吸附在熱點附近分子的取向Ω發生變化(定向漂移)也會影響光譜的波動.因為分子的吸附方式可能是平躺、傾斜或垂直于金屬表面, 在這種情況下分子的偶極矩方向可能會表現出與熱點中電磁場的極化方向不一致的情況, 這種差異在SM-SERS光譜中可以明顯被觀察到.Marshall等[72]基于實驗測量和模擬計算證明該研究中所制備的銀納米球腔體具有SM-SERS檢測能力, 并發現來自納米間隙的SM-SERS信號強烈依賴于分子取向.在單分子體系中, 分析物的隨機取向不再是許多分子的平均,因此必須考慮分子拉曼活性偶極矩相對于增強電場極化的方向.結合密度函數理論計算結果與光譜實驗, 作者確定了等離激元納米間隙中分子的取向分布情況, 如圖8所示.這種在單分子水平上對分子取向的研究和確認對于分子電子器件方面的研究具有重要借鑒意義.該研究團隊隨后繼續在這一納米系統中研究了單分子級別共軛聚合物分子的取向分布情況[73].結合理論計算和SM-SERS光譜數據得出共軛聚合物分子鏈相對于金屬表面更容易呈現平行吸附模式.該實驗為理解共軛聚合物在金屬表面的取向分布, 優化共軛聚合物器件(如: 有機發光二極管等電子器件)提供了可靠的實驗支撐.

圖7 單個分子漂移行為的探究[58] (a) SERS質心位置在二維空間中出現的次數(右邊色條代表事件次數); (b) 在每個質心位置測得的平均SERS強度, 其中納米粒子發射質心設置為(0, 0); (c) SRER質心的位置和強度隨時間發生變化, 這表明單個探針分子在熱點附近發生漂移Fig.7.Study on the diffusion behavior of a single molecule[58]: (a) The number the SERS centroid position that appears in two-dimensional space during the detection (the right color bar represents the number of events); (b) the average SERS intensity measured at each centroid, where the emission centroid of nanoparticles is set to (0, 0); (c) the intensity and position of SERS centroid change with time, which indicates that single molecule wanders around the hot spots.

圖8 SM-SERS中分子不同取向對光譜產生波動影響[72] (a) 銀納米腔體結構示意圖; (b) 光譜1—3表示納米間隙中不同取向分子的SM-SERS信號, 光譜4表示高濃度普通SERS光譜; (c) Rh6G分子的結構以及不同場方向在分子α-γ和α-β平面上的投影Fig.8.The effects of molecular orientations on spectrum fluctuations in SM-SERS[72]: (a) Schematic diagram of silver nanocavity structure; (b) spectrum 1–3 is SM-SERS signals of molecules with different orientations in the nan-gap, and spectrum 4 is the SERS spectrum of high concentration molecules; (c) the chemical structure of Rh6G molecule and the projection of different field directions on the α-γ and α-β planes of this molecule.

SM-SERS的另一個重要應用在于對催化反應內在機理的研究, 催化反應涉及復雜的反應步驟和多樣的中間產物, 實驗中往往只能觀察到最終產物或幾種重要的中間產物, 而對大多數的中間過程無法進行系統地研究.SM-SERS技術可以對化學反應過程進行實時監測, 能夠對反應過程的中間產物結構及反應步驟進行化學反應動力學分析, 有助于研究人員從微觀狀態研究和認識化學反應的本質.但是在實際操作中, 對于給定的SM-SERS軌跡中的單個事件, 研究人員無法確定該事件是由化學反應引起的還是因為單個分子發生漂移或者其他非反應過程所導致.基于此, Choi等[65]通過在“銀納米球-金膜”結構的納米間隙中吸附4-NTP分子對這一問題進行了研究, 如圖9所示.在波長為633 nm的激發條件下, 作者觀察到了隨時間變化并且具有階躍特征的SERS光譜, 并認為這些光譜的階躍信號對應于單個分子在熱點處發生的化學反應事件.由于單個分子在熱點中發生漂移時只涉及物理變化而與化學反應無關, 因此光譜的階躍頻率f與分子的衰減速率常數kNBT之間不存在線性關系.然而, 作者在該實驗中發現4-NTP分子的衰減速率常數kNBT與光譜的階躍頻率f呈明顯的線性依賴關系, 如圖9(d)所示.因此, 作者認為實驗中觀察到的光譜波動現象是由化學反應所導致, 從而排除了分子發生漂移的可能性.

圖9 (a)“銀納米球-金膜”納米腔體結構用于SERS測量及納米腔暗場散射光譜[65]; (b) 催化反應生成中間產物的間歇性光譜特征軌跡[65]; (c) 在開(紅)和關(藍)期間從圖9(b)中取樣的SERS光譜, 兩者光譜的差異(橙)及其協方差矩陣VX = 1364 cm–1分量(綠).在1160, 1314, 1364 cm–1處出現間歇性SERS峰歸因于中間產物羥胺基苯硫醇分子的拉曼峰[65]; (d)光譜的上升沿階躍頻率fup(左)和下降沿階躍頻率fdown(右)與4-NTP分子的衰減速率常數kNBT之間的關系[65]Fig.9.(a) The “silver nanosphere-gold film” nanocavity structure in SERS measurement[65] (This figure contains chemical structures of NBT and DMAB molecules, as well as the dark field scattering spectrum of a single nanostructure cavity); (b) the trace of the intermittent spectral characteristics of intermediates generated by catalytic reaction[65]; (c) SERS spectra sampled from Fig.9(b)during on (red) and off (blue), the differences between the two spectra (orange) and the VX = 1364 cm–1 component (green) of the covariance matrix.The intermittent SERS peaks at 1160, 1314 and 1364 cm–1 are attributed to the Raman peaks of the intermediate product hydroxyl aminobenzenethiol[65]; (d) the relationship between the spectral step-up frequency fup (left) and step-down frequency fdown (right) and the decay rate constant kNBT of 4-NTP molecule[65].

基于上面的討論分析, 我們總結出在SM-SERS中分子的漂移分為兩種情況: 橫向與定向.對于橫向漂移而言, 由于分子在熱點內外做無規則隨機運動, 分子經歷了不同強度的局域電磁場使得SERS強度發生變化.在定向的漂移中, 分子在金屬表面的吸附方式不同造成分子的取向與局域電磁場極化方向存在差異, 導致拉曼峰的相對強度發生變化.在SM-SERS信號采集實驗中, 這兩種漂移方式有可能是同時存在的, 并且隨著光譜采集時間的推移, 我們也會從光譜數據中發現分子在某些波數處的拉曼峰強會出現類似“強-弱”交替的循環現象, 這就是接下來要討論的SM-SERS中的“閃爍”現象.

3.2 光譜閃爍

一般在采集SM-SERS光譜時會發現探針的拉曼信號在某個波數處發生波動, 該現象被稱為閃爍, 它是SM-SERS中光譜信號發生“開-關”循環并且可以持續幾毫秒甚至幾分鐘的一種實驗現象.通常認為分子發生漂移是SM-SERS發生閃爍的根本來源.當金屬納米結構的形貌、顆粒之間的間距及激發波長等外在實驗條件確定后, 襯底的熱點強度和分布不會發生明顯地變化, 但是處在熱點中的單個分子會在熱點內外產生漂移, 導致該單個分子經歷不同強度的電磁場(幾個數量級的變化)[22],這是SM-SERS中閃爍現象的根本原因.隨著SMSERS研究進一步的深入, 有研究表明溫度升高產生的熱效應[74?77]、電荷轉移[61,67]及其他因素[61,78]也是誘導單分子閃爍的原因.下面將對SM-SERS閃爍背后的基本理論和相關工作做具體討論.

單分子光譜波動的實驗現象一直存在.在光譜測量過程中, 不管是拉曼信號還是熒光光譜信號都會出現這樣的情況.為了更清晰地揭示該現象背后的物理機制, Haran工作組[78]在銀納米晶體上吸附Rh6G分子, 并在532 nm光源的激發下觀察到了單個Rh6G分子在數秒級的時間尺度上發生了閃爍現象, 如圖10所示.作者研究了不同條件下單個Rh6G分子的SERS光譜動力學, 并進行了統計分析.研究發現, 單個Rh6G分子的SERS信號隨時間波動的尺度取決于激光的功率(非光熱)和電解質的濃度.隨著激光功率的提高, 光譜波動尺度增大.作者認為其主要原因是由金屬與吸附分子之間的電荷轉移所導致的.此外, 另一種解釋是由于分子在金屬表面運動所致.而這種運動可能是源于單個分子與金屬表面發生了“脫吸-再吸附”的現象.然而, 隨著膠體中鹽溶液濃度的增加, 膠體顆粒周圍雙層的靜電勢發生變化, 影響金屬表面的局域功函數(局域電荷密度), 從而導致SM-SERS的光譜波動被強烈抑制.該工作為后續研究SMSERS中的閃爍現象提供了理論依據.

圖10 SM-SERS的閃爍現象[78]: 單個Rh6G分子SERS信號隨時間變化的軌跡圖, 其中在波數614 cm–1和774 cm–1處發生明顯的光譜波動Fig.10.The Blinking phenomenon in SM-SERS [78]: The time-dependent trajectories of SERS signal of a single Rh6G molecule.Obvious spectral fluctuations are observed at 614 cm–1 and 774 cm–1.

Maruyama等[76]通過實驗證明了溫度升高產生的熱活化效應會導致SERS光譜產生閃爍現象.實驗發現SM-SERS光譜閃爍現象與溫度有關.當溫度變化時, 研究者觀察到了拉曼光譜閃爍現象的發生-抑制-復現.考慮到熱效應可能對金屬納米顆粒形貌有影響, 作者通過改變激光功率及在高溫環境中退火1 h后, 發現金屬的形貌沒有發生明顯的變化, 排除了局域電場變化對探針分子信號的影響.因此, 作者認為溫度升高產生的熱效應導致單分子拉曼信號發生閃爍現象.這可能是由于Ag表面等離激元熱效應提供了足夠大的熱能克服了分子的擴散勢壘, 使得分子能夠在金屬表面發生漂移.隨后聶書明課題組[61]也研究了SM-SERS中閃爍的現象, 提出閃爍是由單個分子在納米顆粒表面上的熱活化擴散引起的, 并認為激光的功率、波長、光誘導的電子轉移及表面活性位的結構弛豫可能是導致閃爍的原因.最近, Lindquist[79]等通過快速成像技術發現金屬納米結構表面的原子擴散引起熱點變化也是導致SM-SERS發生閃爍現象的一個原因.研究人員利用一種捕獲率為800000幀/s并且空間分辨率為7 nm的成像技術對銀納米殼層表面單個分子的拉曼光譜進行探測, 如圖11所示.實驗發現在金屬表面被化學鍵固定的分子的SERS光譜信號以一定的速度在發生波動.作者通過進一步的觀察和研究推斷出金屬表面銀原子的重構驅動熱點產生移動是導致SERS波動的原因, 其模擬分析結果與推斷結論幾乎一致.

圖11 高速SERS信號采集和超分辨率成像[79] (a) SM-SERS放大后的兩個波動圖, 每個持續約0.3 ms, 相距61 ms; (b)光電探測器上接收到兩個易于區分的光譜波動事件成像; (c)在納米粒子的空間位置上繪制的三個光譜波動軌跡Fig.11.High-speed SERS acquisition and super-resolution SERS imaging[79]: (a) Each of two amplified wave patterns of SM-SER spectra lasted for about 0.3 ms and separated by 61 ms; (b) images of spectral fluctuation events; (a) three spectral wave trajectories on the spatial position of nanoparticles.

通過上述典型的研究報道可以將SM-SERS發生閃爍的原因歸結如下: 1)由于熱效應導致熱點附近的單個分子發生漂移擴散; 2)分子與金屬表面存在電荷轉移; 3)在溶液體系中由于分子做無規則運動導致分子在納米結構表面發生脫吸和再吸附的過程; 4)染料分子發生光漂白; 5)熱點擴散.雖然與閃爍相關的研究工作較多, 但是該研究仍是一個有爭議的話題.目前大多數研究只是通過實驗定性地分析了閃爍的原因, 因此仍然需要做進一步工作從實驗現象背后的物理機制來分析該現象.在采集SM-SERS光譜時, 分子的閃爍是我們要注意的一個現象.因為通過SM-SERS光譜研究單分子化學反應過程需要區分到底是反應導致的光譜發生波動還是發生了閃爍現象, 這就要求我們選擇合適的激光功率和波長、溫度及適宜的環境體系等來避免閃爍現象對實驗的影響.

3.3 光譜頻移與展寬

在拉曼光譜中可以觀察到均勻展寬和非均勻展寬的現象, 前者源于分子內的非諧相互作用, 這是單分子振動的一個基本特性, 而后者則代表了分子在樣品中不同位置中的變化[21].在收集SM-SERS光譜時, 研究者發現這些單個分子的光譜擬合成平均光譜后, 光譜呈現出不對稱的洛倫茲曲線, 這種現象叫做SM-SERS光譜的不均勻展寬現象.另外, 隨著溫度的升高SM-SERS光譜的譜寬表現出增大趨勢, 該現象稱之為SM-SERS光譜的均勻展寬.在SM-SERS中, 分子間的相互作用及分子與周圍環境的相互作用都會導致光譜出現展寬現象.

Etchegoion等[62]在低溫環境下, 利用高分辨光柵(2400 mm–1)觀察了尼羅藍分子和羅丹明800分子分別在590 cm–1和2226 cm–1處的不均勻展寬現象, 如圖12(a)和12(b)所示.作者擬合了大量的單分子光譜后發現, 與正常的多分子光譜相比, 擬合的平均光譜呈現出不對稱分布的現象.作者認為不均勻的展寬是由于分子間的相互作用或分子在底物上的相互作用引起的, 并且單個分子光譜之間拉曼峰的頻率差異是導致非均勻展寬的主要原因.此外, 作者從分子與基底的相互作用,同位素效應, 還有儀器方面解釋和討論了單分子光譜頻率發生移動的可能來源.研究結果表明同位素位效應、光譜儀響應不完全是頻率漂移的主要原因.對同一分子不同峰的不均勻展寬進行數據統計分析將有助于揭示和理解分子與周圍環境相互作用的具體行為細節.隨后該課題組[21]又研究了溫度變化對單個尼羅藍分子拉曼增強光譜在590 cm–1處的均勻展寬現象的影響.隨著溫度的升高單分子光譜的半高寬發生均勻展寬現象(半高寬大約從0.9 cm–1增加到2.7 cm–1附近), 如圖12(c).作者認為隨著溫度升高光譜出現均勻加寬的現象是由于分子與基底銀聲子發生非簡諧耦合所導致.研究SM-SERS的光譜展寬現象, 有助于進一步了解分子與其周圍環境的相互作用(分子之間或分子與基底之間)及溫度等外在因素對分子自身行為的影響.

圖12 SM-SERS光譜的展寬現象 (a)單個尼羅藍染料分子在590 cm–1能量振動處的不均勻展寬現象[62]; (b)單個羅丹明800分子在2226 cm–1能量振動處的不均勻展寬現象[62]; (c) SM-SERS事件中單個尼羅藍分子在590 cm–1處光譜的半高寬(Γ)與溫度(T)之間的關系, 表明隨著溫度T升高SM-SERS光譜發生均勻展寬[21]Fig.12.Broadening of SM-SERS spectrum: (a) Inhomogeneous broadening of a single Nile Blue dye molecule at 590 cm–1 energy vibration[62]; (b) inhomogeneous broadening of a single Rhodamine 800 molecule at 2226 cm–1 energy vibration[62]; (c) the relationship between the FWHM (Γ) of a single Nile Blue molecule indifferent SM-SERS events at 590 cm–1 with increasing temperature T. The result indicates that the SM-SERS spectrum broadens uniformly with the increase of temperature (T)[21].

3.4 小 結

拉曼光譜信號波動現象是SM-SERS光譜最明顯且重要的特征.雖然研究人員當前已經從溫度、激發條件、電荷轉移等影響因素分析了SMSERS光譜波動的原因, 但是如果要深究其背后的理論機制及相關的應用仍然需要做進一步的工作.目前對該系統的研究和理解尚不夠全面, 而單分子納米級別的系統中是一個復雜的狀態, 并且影響光譜波動的因素還可能與分子本身及分子所處的環境有關, 如: SM-SERS的振動涌出現象及高壓環境誘導SM-SERS峰位發生藍移現象等[64,80,81].因此, 在SM-SERS光譜波動的研究中需要盡可能設計合理巧妙的實驗方法來排除其他因素的干擾.目前已經有報道通過在金屬表面構造超薄的殼層來避免電荷轉移對光譜波動的影響[53]; 而且研究人員利用物理、化學及生物等手段制備出的超靈敏檢測基底已滿足SM-SERS的檢測靈敏度, 但是如何對單個分子進行精確地操控使靶分子能夠有效吸附到“熱點”區域并減弱或者排除單個分子光譜波動對分子動力學研究的干擾影響, 仍然有待進一步的討論和分析.

4 總結與展望

本文重點研究和探討了SM-SERS的信號的獲取方法, 以及SM-SERS的光譜波動特性和相關機理.SM-SERS的優勢在于其對分子及亞分子化學鍵的特異性識別能力, 這項技術已經被初步應用于監測催化反應過程[44,45,57,82]及生物分子測序[55,56,83,84]等領域.此外, SM-SERS對化學鍵特異性識別的能力也使得研究分子與周圍環境的電荷相互作用成為可能, 這被應用于確定分子的吸附構型、吸附取向分布[36]; 研究分子在光激發作用下的解吸附過程[67]; 觀察分子與基底之間的電荷轉移等[85].另一方面, 隨著表征儀器不斷的發展, 近年來研究者人員在SM-SERS檢測中結合TERS技術能夠在單分子水平中區分結構相似的待檢測分子, 其亞納米級別的空間分辨率可以顯示出單個分子的分布狀態、振動模式及吸附方式等重要信息, 該技術有望被推廣到單分子成像研究領域[33?38,86?88].

然而, SM-SERS在信號采集和數據處理方面需要更加可靠的技術和嚴謹的方法, 除了本文已提到的部分, 還需要注意: 1)在SM-SERS光譜收集實驗中, 激發條件、溫度、光柵分辨率及光譜儀中CCD的曝光時間等因素會導致光譜波動或影響光譜采集效果.所以在研究分子動力學的過程中, 需要考慮并優化實驗方法排除這些因素對實驗結果的影響.2)雙分子分析方法假設每個納米間隙之間形成的“熱點”都會提供等效的增強因子.而實際上納米顆粒之間的間隙以及形貌難以完全統一, 這種假設在實驗中很難實現.因此, 需要建立更加完善和健全的統計方法使SM-SERS檢測更具有科學合理性.3)分子總是處于變化且復雜的狀態, 揭示單個分子的自身行為, 以及與周圍環境的相互作用時要考慮到瑞利散射和量子效應等其他的物理效應[19].4)在TERS技術中, 如何能夠穩定、有效地制備出具有幾個金屬原子組成的超高局域電磁場分布并實現單分子檢測的針尖仍然是一個挑戰.

本文從SM-SERS的內涵, SM-SERS信號的獲取及SM-SERS的光譜特征等方面進行了初步的探討.由于SM-SERS技術能夠提供極高的靈敏度及單個分子在待測環境中的行為特征, 因此該技術有望用于單分子表征分析等相關領域.希望本文能夠引起讀者的興趣和對本領域的關注, 在機理分析和實驗構筑等層面上進一步拓展和豐富SMSERS的相關研究.