CASQ2基因c.381C＞T突變致兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速的分子機(jī)制

李翠蘭，袁越，劉文玲，胡大一

長 QT 綜合征（LQTS）是一種心臟離子通道病，表現(xiàn)為心電圖上QT 間期（QTc）延長，T 波異常，易產(chǎn)生尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速、心室顫動等惡性心律失常，進(jìn)而可引起暈厥甚至心臟性猝死。目前已經(jīng)報道的基因亞型至少有15 個[1]。兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速（CPVT）是另一種離子通道病，常表現(xiàn)為無器質(zhì)性心臟病個體在交感神經(jīng)興奮狀態(tài)下發(fā)生雙向（bVT）或多形性室性心動過速（pVT），可發(fā)展為心室顫動，引起患者暈厥，甚至猝死。目前發(fā)現(xiàn)的致病基因主要有2 個：RyR2和CASQ2[2]。這兩種疾病都是少見但嚴(yán)重的遺傳性心律失常，是青少年發(fā)生暈厥、猝死的重要原因。LQTS 有不完全外顯現(xiàn)象，有些患者QTc 并不延長或只是臨界值，有時QTc 在正常范圍或臨界值但又伴有顯著U波，暫且稱之為長QTU（LQTU）綜合征。已有報道LQTS7 型（亦稱1 型Andersen-Tawil 綜合征）[3-4]和某些CPVT 患者[5]心電圖都可表現(xiàn)有顯著U 波。當(dāng)心電圖特征不典型時臨床上很難區(qū)分到底是LQTS還是CPVT。目前主要通過心電圖特征、臨床特點，并結(jié)合基因檢測結(jié)果進(jìn)行診斷及鑒別分型。本研究對2 個心電圖上有顯著U 波，首診懷疑LQTU 綜合征的家系進(jìn)行了全外顯子篩查以期找到致病基因突變并確診分型及發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象及臨床資料的收集

篩查對象是2004～2005年來我院就診的兩個初診為LQTU 綜合征的家系L79 和L104。初步診斷的依據(jù)主要來自于臨床特征，如交感神經(jīng)興奮相關(guān)的暈厥，心電圖記錄到QTc[或QU 間期（QUc）]延長及室性心動過速，無器質(zhì)性心臟病。記錄先證者及其父母和一級親屬的病史、心電圖和家族史，包括12 導(dǎo)聯(lián)靜息心電圖、24 h 動態(tài)心電圖和運(yùn)動試驗等結(jié)果。基因篩查研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本處置方法

DNA 提取：在征得患者知情同意后，抽取患者及其父母或一級親屬的外周靜脈血樣2 ml，置于EDTA 抗凝管中。用全血基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，并檢測DNA 的濃度及純度。

患者基因組DNA 全外顯子測序：兩個家系基因篩查分別在上海藥明康德醫(yī)學(xué)檢驗所和北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗所完成。取患者2 μg 基因組DNA，打斷至200～300 bp，構(gòu)建基因組DNA 文庫。對基因組DNA文庫進(jìn)行人類全外顯子捕獲。對捕獲序列進(jìn)行二代測序、生物信息學(xué)分析及數(shù)據(jù)庫注釋，并按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會（ACMG）指南對變異位點進(jìn)行致病性分析。

1.3 Sanger 測序

對于檢測到的疑似致病變異，采用軟件對目標(biāo)位點及所在外顯子（Exon）上下游區(qū)域設(shè)計引物，對先證者及其家系成員進(jìn)行突變檢測和驗證，應(yīng)用軟件進(jìn)行突變致病性分析，并分析變異對蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響，并根據(jù)家系患病情況對疑似致病性變異位點進(jìn)行家系共分離分析。

1.4 微小基因（minigene）功能驗證

這部分實驗分兩部分。設(shè)計分別涉及CASQ2Exon 2/3/4 編碼區(qū)域和Exon 8/3/10 編碼區(qū)域。

分別構(gòu)建CASQ2（NM_001232.4:c.381C＞T）野生型minigene 質(zhì)粒和CASQ2（NM_001232.4:c.381C＞T）突變型minigene 質(zhì)粒，克隆載體：pEGFP-C1；克隆位點：XhoI/BamHI；插入序列信息：Exon 2+內(nèi)含子（Intron）2（前后各保留1 K）+Exon 3+Intron 3+Exon 4或者（Exon 8 加右側(cè)翼200 bp）+（Exon3 加左右側(cè)翼200 bp）+（Exon10 加左側(cè)翼200 bp）。

質(zhì)粒構(gòu)建方法：采用無縫克隆方式設(shè)計引物分別擴(kuò)增對應(yīng)Exon 2/3/4 和Exon 8/3/10 及部分相鄰Intron 序列的正常人基因組DNA 和攜 帶CASQ2（NM_001232.4:c.381C＞T）突 變位點的人基因組DNA，分別獲得3 個野生型目的片段和3 個突變型目的片段插入基因。有關(guān)Exon2/3/4 的引物信息如下：CASQ2-mini-AF/CAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTTGTGGCC CAGGTCCTTGAACATAAAGC，CASQ2-mini-AR/GTCCAATTGCTGTCAGTGTTTGAAAATCAGAGG AGCGG；CASQ2-mini-BF/AACACTGACAGCAAT TGGACTAAATGCCAGCTTTGTTT，CASQ2-mini-BR/TAGCTTCCAACTCACTTCTGACCTTCCCTC;CASQ2-mini-CF/CAGAAGTGAGTTGGAAGCTA CATTTACCAA,CASQ2-mini-CR/AGTTATCTAG ATCCGGTGGATCCATTCTGAGTCCTCACTCTTG AAAAAGCCA。有關(guān)Exon 8/3/10 的引物信息如下：CASQ2-E8N-F/CAAGTCCGGACTCAGATCT CGAGGAAGATGATTTGAATGGGATC，CASQ2-E8N-R/ATTGGAAATAGTCCAGAATTTGTTCACAC CTTTTCTTCTCTTAGCCGTGTGC；CASQ2-E3N-F/TCTGGACTATTTCCAATTAAATG，CASQ2-E3N-R/CA TAGCATAATTCTAGGGTGGCTTAAAGATCAC；CASQ2-E10N-F/CCCTAGAATTATGCTATGTCATCTTTTATTTAA TGCTTATTTG，CASQ2-E10N-R/AGTTATCTAGATCCGGT GGATCCATCTGTGACATTCACCACCCCAATC。

將上述PCR 產(chǎn)物無縫克隆到pEGFP-C1 載體，分別命名為pEGFP-C1-CASQ2-W 和pEGFP-C1-CASQ2-M-c.381C＞T。用上述兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，并于48 h 后提取293T 細(xì)胞總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳和DNA 測序技術(shù)，鑒定微小基因表達(dá)產(chǎn)物，闡明該CASQ2突變的致病機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 L79 家系研究結(jié)果

臨床發(fā)現(xiàn)：先證者女性，31歲，5歲時首次發(fā)生暈厥，QTc 0.44～0.49 s,QUc 0.64 s。母親QTc 0.51 s。曾被診斷為癲癇，9歲時診斷為LQTS。9～15歲期間發(fā)作暈厥3～4 次，15～28歲暈厥兩次。近3年服用普萘洛爾（2.11 mg/kg）無暈厥。童年期心電圖上有顯著U 波，隨著年齡增加U 波不再明顯（圖1A～1C）。父母、姐姐均無暈厥史。

圖1 兒茶酚胺敏感性多形性室性心動過速患者的心電圖U 波表現(xiàn)

基因檢測結(jié)果（圖2A）：該患者根據(jù)心電圖特點可初步診斷為LQTS 1 型（LQT1）或者CPVT。曾用直接測序法發(fā)現(xiàn)先證者攜帶KCNQ1/c.921+1G＞T雜合突變，其母親和姐姐亦為雜合攜帶[6]。全外顯子基因篩查在先證者CASQ2基因上檢測到c.381C＞T（p.Gly127=）純合變異。在千人基因組數(shù)據(jù)庫（1 000 Genome）、人類Exon組整合數(shù)據(jù)庫等多個正常人數(shù)據(jù)庫中均未見該變異。經(jīng)家系Sanger 驗證，其父母、姐姐均雜合攜帶，提示該變異分別來源于父母親。CASQ2基因c.381C＞T 變異位點在人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）曾被報道與常染色體隱性遺傳CPVT 2 型相關(guān)，根據(jù)ACMG指南，該突變位點評級為疑似致病性變異。患者臨床表現(xiàn)與CPVT 2 型符合。結(jié)合臨床信息，可以診斷此例先證者為CPVT 伴LQT1，其母親、姐姐為LQT1 無癥狀者。

圖2 家系圖及CASQ2 基因測序圖

2.2 L104 家系研究結(jié)果

臨床情況：先證者（L104-01）女性，20歲，5歲首次暈厥。心電圖上QTc 0.43～0.44 s，QUc 0.71 s（V1～3）,V2導(dǎo)聯(lián)U 波顯著，幅度達(dá)到0.2 V，U 波幅度隨年齡增加而降低，形態(tài)也有所變化（圖1D～1F）。首次暈厥期間心電圖記錄到短陣bVT 和pVT。24 h動態(tài)心電圖記錄到心率快時（124 次/min）QTc 可達(dá)0.52 s。現(xiàn)服用美西律（9.78 mg/kg）和普萘洛爾（1.96 mg/kg），隨訪至今15年無暈厥，但最近隨訪發(fā)現(xiàn)有頻發(fā)室性早搏二聯(lián)律出現(xiàn)。對患者24 h 動態(tài)心電圖記錄中的室性早搏和U 波偶聯(lián)間期隨機(jī)測量發(fā)現(xiàn)，室性早搏聯(lián)律間期與U 波到達(dá)峰頂時間QUpeak 基本一致，提示室早可能起源于U 波。先證者的妹妹（L104-02）5歲首次暈厥發(fā)作，心電圖上亦有顯著U 波，且隨年齡增加而降低（圖1G～1I）。QTc 0.40 s，QUc 0.70 s。服用美西律（7.81 mg/kg）和普萘洛爾（1.25 mg/kg），至今7年無癥狀。父母心電圖均正常。

全外顯子基因檢測結(jié)果：患者被初步診斷為LQTU 綜合征，根據(jù)Zhang 等[4]關(guān)于ATS 基因型表型關(guān)系研究預(yù)測可能為LQTS7 型，但對KCNJ2基因篩查結(jié)果陰性（數(shù)據(jù)未提供）。全外顯子基因篩查發(fā)現(xiàn)，先證者攜帶有CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）純合突變，妹妹亦攜帶此純合突變，其父母均雜合攜帶（圖2B）。結(jié)合患者臨床表現(xiàn)，CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）純合突變可能是導(dǎo)致該家系這兩例患者發(fā)病的原因。

2.3 CASQ2/c.381C＞T 的minigene 功能驗證結(jié)果

c.381C＞T 變異位于3 號Exon 上，首先進(jìn)行了包含Exon2/3/4 的minigene 驗證實驗。PCR 擴(kuò)增正常組預(yù)期序列為421 bp（T 后序列為載體轉(zhuǎn)錄序列，第一個C和T之間的序列為目的基因Exon轉(zhuǎn)錄序列，第二個C 為突變位點處）：catggtcctgctggagttcgtgaccgc cgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcg agCttgtggcccaggtccttgaacataaagctataggctttgtgatggtggatgcc aagaaagaagccaagcttgccaagaaactgggttttgatgaagaaggaagcctg tatattcttaagggtgatcgcacaatagagtttgatggCgagtttgcagctgatgtct tggtggagttcctcttggatctaattgaagacccagtggagatcatcagcagcaaa ctggaagtccaagccttcgaacgcattgaagactacatcaaactcattggctttttca agagtgaggactcagaaTggatccaccggatctagataactgatcataatcagcc ata。

但是結(jié)果在野生型和突變型的樣本均檢測到了2 個條帶（圖3）。將野生型和突變型的2 個條帶分別進(jìn)行Sanger 測序，通過比對發(fā)現(xiàn)：（1）大條帶結(jié)果示3 號Intron 上存在一個選擇性剪接位點，使用該位點的轉(zhuǎn)錄版本，可使3 號Exon 序列增加54 bp，增加序列為：tgaagaaggaaatctcttgtttgaacatgtgtgtatgtgcgtg tggcatttcag。對野生型來講，此時編碼Exon 3 的序列結(jié)束在第420 位置，之后直接遇到TGA 終止密碼子（圖3A），而對于c.381C＞T 突變型來講，突變導(dǎo)致編碼序列380_420 段缺失，第379 位核苷酸直接連接這54 bp 核苷酸（圖3B），在第438 位核苷酸之后遇到TGA 終止密碼子。（2）小條帶結(jié)果示c.381C＞T突變位點造成了3號Exon上380_420段41bp堿基缺失，缺失序列為：gTgagtttgcagctgatgtc ttggtggagttcctcttggat；由于這41 bp 的堿基缺失，第379 位核苷酸后直接連接4 號Exon（圖3C、3D），導(dǎo)致編碼序列在第384 個核苷酸之后提前產(chǎn)生終止密碼子TGA，預(yù)測翻譯產(chǎn)物為只包含128 個AA的截短蛋白。而野生型的3 號Exon 則以正常剪接順序和4 號Exon 進(jìn)行了連接，預(yù)測可產(chǎn)生399 個AA 的完整全長蛋白。匯總上述序列比對結(jié)果畫出了剪接示意圖見圖3E。

圖3 利用CASQ2 Exon 2/3/4 序列進(jìn)行的微小基因技術(shù)驗證結(jié)果

其次，假如3 號Exon 后面的Intron 上無選擇性剪接位點，剪接情況是否如預(yù)期一樣可以順利形成Exon 之間的連接？為此，本研究又設(shè)計了Exon 3 前后分別為8 號和10 號Exon 序列的實驗。PCR 擴(kuò)增正常組預(yù)期序列為354 bp（G、T 之間的序列為目的基因Exon 轉(zhuǎn)錄序列，前后為載體轉(zhuǎn)錄序列，C 為突變位點處）：catggtcctgctggagttcgtgaccg ccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagat ctcgagGaagatgatttgaatgggatccacattgtggcctttgcagagaaga gtgatccaggttttgatgaagaaggaagcctgtatattcttaagggtgatcgca caatagagtttgatggCgagtttgcagctgatgtcttggtggagttcctcttgga tctcgttgcctactgggagaagactttcaagattgacctattcaggccacaga ttggggtggtgaatgtcacagaTggatccaccggatctagataactgatcata atcagccata。結(jié)果在野生型和突變型的樣本均檢測到了單個條帶（圖4A～4B）。Sanger 測序比對發(fā)現(xiàn)，c.381C＞T 突變位點與預(yù)期一致，造成了3 號Exon 上380_420 段41 bp 堿基缺失（圖4C），缺失序列為：gTgagtttgcagctgatgtcttggtggagttcctcttggat。

圖4 利用CASQ2 Exon 8/3/10 序列進(jìn)行的微小基因技術(shù)驗證結(jié)果

3 討論

本研究首次在2 個家系中的3例中國LQTU 患者中發(fā)現(xiàn)CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）純合突變可引起CPVT，并通過minigene 驗證法證實這個位于Exon 編碼序列內(nèi)的同義突變c.381C＞T（p.Gly127=）發(fā)揮作用的機(jī)制，是通過形成新的剪接位點而引起碼內(nèi)跳讀，最終提前產(chǎn)生終止密碼子而產(chǎn)生截短蛋白。另外發(fā)現(xiàn)這些CPVT 患者表現(xiàn)為在心電圖上QTc 偶有臨界值延長，但以顯著U 波為主，并有U波隨年齡增加而幅度降低的現(xiàn)象。這些結(jié)果豐富了中國CPVT 患者的基因突變譜。

CPVT 是常發(fā)生在青少年中的一種原發(fā)性惡性心律失常，目前發(fā)現(xiàn)主要和編碼雷諾丁受體（RyR2）和集鈣蛋白（CASQ2）的基因突變有關(guān)。CASQ2 蛋白是肌漿網(wǎng)內(nèi)主要的Ca2+儲存蛋白，通過接頭蛋白/三合蛋白鉚定在RyR2 上，作為肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+緩沖劑和RyR2 對腔內(nèi)Ca2+敏感性的調(diào)節(jié)器來調(diào)節(jié)鈣瞬變恢復(fù)（Ca2+transient restitution）。CASQ2不同突變可通過上述幾個環(huán)節(jié)形成舒張期鈣滲漏[2,7]。已知與CPVT 有關(guān)的CASQ2突變有28 個，其中在中國CPVT 患者中發(fā)現(xiàn)7 個突變[8-10]。

Roux-Buisson等[11]報道，CASQ2/c.381C＞T+c.546delT 復(fù)合雜合突變可引起一家系內(nèi)患者CPVT 癥狀。于是Roux-Buisson 等在CASQ2/c.381C＞T 所處的3 號Exon 前后各使用8 號和10 號Exon序列進(jìn)行minigene功能驗證，結(jié)果證實c.381C＞T（p.Gly127=）突變雖未引起編碼氨基酸變化但其改變了3 號Exon 后面的生理性剪切位點并引入了一個新的剪切位點，致使其后40 個核苷酸缺失，并在第128 位置產(chǎn)生提前終止密碼子（PTC）。該患者的CPVT 可 能 是CASQ2/c.381C＞T 和c.546delT 兩 個 突變共同作用的結(jié)果。

為何Roux-Buisson 等在minigene 驗證CASQ2/c.381C＞T 功能時選用Exon 8/10，而非前后順序銜接的Exon 2/4？就此，本研究設(shè)計了使用Exon 2/3/4序列的minigene 驗證實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在對照個體及CPVT 患者，除了Exon 3 后的正常剪接位點外，在Exon 3 后面的3 號Intron 上均存在另一個選擇性剪接位點（圖3），導(dǎo)致出現(xiàn)2 個條帶。測序結(jié)果分析表明，正常人使用選擇性剪切位點時生成140 個AA 的截短蛋白，而使用正常剪切位點時可生成399個AA 的完整全長蛋白。但攜帶CASQ2/c.381C＞T 純合突變的患者不管使用正常剪切位點還是使用選擇性剪切位點都生成截短蛋白（128 個AA 和146 個AA）。所以，CASQ2/c.381C＞T 突變攜帶者與正常人的差別可能不是通過這個選擇性剪切位點造成的（反正都生成了截短蛋白，隨后可能降解掉），而是在使用正常剪切位點時突變攜帶者產(chǎn)生截短蛋白，但正常人不會。接著本研究又設(shè)計了與文獻(xiàn)一樣使用Exon 8/3/10 序列的minigene 驗證實驗，均得到和文獻(xiàn)[11]報道一致的結(jié)論，只是發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中作者由于計算錯誤，把缺失41 個核苷酸誤報成了40 個。

Rizzi 等[12]在CASQ2-R33Q 純合突變基因敲入小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，該突變通過增加CASQ2-R33Q 的降解而降低CASQ2 蛋白含量，致肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣含量降低，連接腫脹，CASQ2 突變蛋白之間的聚集受損。CASQ2 蛋白是肌漿網(wǎng)內(nèi)主要的Ca2+儲存蛋白，作為僅有1 個AA 改變的錯義突變R33Q 尚且如此，而 c.381C＞T 的純合突變可導(dǎo)致蛋白截短至不足原來長度的三分之一，故有理由推測這種變化可能會通過無義介導(dǎo)的mRNA 衰變（nonsense-mediated mRNA decay）或蛋白降解[11]而影響其作為肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+緩沖劑的功能，容易形成舒張期鈣滲漏而觸發(fā)心律失常。

既往有研究提示了CPVT 和U 波的關(guān)系。Aizawa 等[13]2006年在CPVT 患者身上觀察到U 波電交替現(xiàn)象，以及長間歇后負(fù)向U 波可以短暫變成正向U 波。趙東生等[14]也發(fā)現(xiàn)，CPVT 患者靜息狀態(tài)下心電圖常表現(xiàn)為右胸導(dǎo)聯(lián)（V1～3）T 波切跡、雙峰及U 波高大。2008年Viitasalo 等[15]發(fā)現(xiàn)，CPVT患者的最大U 波/T 波幅度比值為0.8±0.6，顯著大于正常對照組的0.4±0.3，β 受體阻滯劑可以降低快速心率下的U 波幅度。這些研究支持CPVT 患者的U 波與延遲后除極（DAD）觸發(fā)活動相關(guān)的假說。同時研究者還發(fā)現(xiàn)室性早搏的偶聯(lián)間期與U 波的偶聯(lián)間期幾乎一致。與這些研究類似，本研究在3例CPVT 患者中發(fā)現(xiàn)在V2導(dǎo)聯(lián)存在顯著U 波，且U 波幅度有隨年齡增加而逐漸降低甚至消失的現(xiàn)象。其中在1例患者觀察到室性早搏聯(lián)律間期與U 波到達(dá)峰頂時間QUpeak 高度一致，提示此例患者室性早搏可能起源于U 波。

本研究中的3例患者中，L79 單純β 受體阻滯劑治療，隨訪近3年無暈厥。另外2例姐妹倆均為β 受體阻滯劑和美西律聯(lián)用，跟蹤隨訪7～15年無暈厥。提示β 受體阻滯劑單獨或聯(lián)用美西律對控制這類CPVT 有效。長期效果還有待于跟蹤隨訪研究證實。

基因篩查及minigene 驗證實驗結(jié)合家系臨床表現(xiàn)最后可確診這3例患者為CASQ2/c.381C＞T（p.Gly127=）純合突變引起的2 型CPVT，L79 先證者同時伴有LQT1。CASQ2引起的CPVT 比較罕見，本研究提示c.381C＞T 可能是國人CASQ2基因的突變熱點，對復(fù)雜表型的遺傳性心律失常患者進(jìn)行全外顯子篩查可以快速定位基因突變，幫助確診。

心原性猝死在中國人群的發(fā)生率為14.48/10萬[16]，而諸如致死率較高的CPVT 在我國幾個主要的兒童與成人心律失常中心的診斷病例均極少，說明絕大多數(shù)一線醫(yī)生對其缺乏認(rèn)識而可能導(dǎo)致誤診[17]。本研究結(jié)果為及早識別CPVT 的疾病特征、了解其發(fā)病機(jī)理、提高對CPVT 的早期診斷和干預(yù)并改善預(yù)后提供了證據(jù)。

本研究的局限性：CPVT 患者癥狀發(fā)作時在心電圖上的典型表現(xiàn)是雙向性或多形性室性心動過速，但其發(fā)病的突發(fā)性使得這個特征不容易被記錄到，所以本研究中只獲得了L104-01 患者的一段短陣雙向及多形室速記錄，另外2例患者沒有室性心動過速記錄，造成開始時的診斷困惑。另外，功能研究部分只進(jìn)行了minigene 驗證實驗，下一步計劃進(jìn)行誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）和轉(zhuǎn)基因動物等全細(xì)胞水平研究，包括免疫印跡，以及細(xì)胞電生理學(xué)參數(shù)等方面的探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突