Ras 同源基因家族蛋白A/Rho 相關卷曲螺旋蛋白激酶抑制劑對冠狀動脈微栓塞引起心肌損傷的預防作用

吳永輝，聶紹平，任鳳學，劉超永

冠狀動脈微栓塞（CME）是冠心病介入治療中常見的并發癥，容易導致冠狀動脈“無復流”以及“慢血流”的現象出現，并伴隨其心肌收縮障礙、炎癥應激和微梗死的發生，危及患者生命[1]。目前尚無更好的技術與手段能量化CME 相關指標，因此給臨床介入的醫護工作者帶來很大挑戰。研究表明[2]心肌細胞的凋亡是CME 發生、發展的關鍵事件。Zhu 等[3]研究證明抑制心肌細胞的凋亡能明顯改善CME 大鼠的心功能。Mao 等[4]研究表明抑制大鼠的線粒體膜電位的下降，能明顯降低凋亡率，緩解CME 大鼠的心臟功能障礙以及結構損傷，但是就CME 時的心肌細胞的凋亡機制至今尚未闡明。Ras 同源基因家族蛋白A（RhoA）/Rho 相關卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）信號通路能夠調控血管平滑肌細胞的收縮、細胞黏附、分化、增殖、遷移和凋亡[5]。研究表明[6]RhoA/ROCK 通路與心血管疾病的發病機制密切相關，諸如高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等，抑制RhoA/ROCK 信號能治療多種心血管疾病，但尚少見RhoA/ROCK 通路在CME 的作用機制的報道。本研究通過建立大鼠CME 模型，來探討RhoA/ROCK 通路在CME 的作用機制，從而為臨床上應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑及儀器

在2020年1月至2020年6月期間，本研究開展動物實驗。8～10 周齡的SD 雄性大鼠，SPF 級，共計60 只，體重在200～220 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0011；依照本院實驗動物管理辦法，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠（4 籠）適應性飼養一周后用于試驗。本研究中所有動物實驗操作均經本院實驗動物管理倫理委員會批準（批準號：2019-032）。

RhoA/Rho 信號通路抑制劑Y-27632（美國Selleckchem 公司），麻醉劑、多聚甲醛（Sigma 公司），蘇木素-伊紅染色（HE）試劑盒、蘇木素堿性品紅苦味酸（HBFP）試劑盒、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）染色試劑盒（上海碧云天生物技術公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒、化學發光試劑盒（廣東銳博生物科技技術股份有限公司），B 細胞淋巴瘤/白血病基因-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）抗體、磷酸化RhoA（p-RhoA）、ROCK1、ROCK2 抗體、兔抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）以及山羊抗兔IgG（美國abcam公司），免疫印跡法（Western blot）試劑盒（德國Rebstock 公司），陽離子脂質熒光探針四氯四乙基苯并咪唑羰花青（JC-1）試劑盒（美國 Amresco 公司）。

熒光顯微鏡（日本尼康公司），Bio-rad 凝膠成像系統（Bio-rad 公司），-80℃深冷冰箱（德國維根斯公司），Leica RM2135組織切片機（德國Leica 公司）。

1.2 CME 大鼠模型的構建及分組

將60 只SD 的大鼠，隨機分為3組，每組20 只：假手術組，模型組，抑制劑組（RhoA/ROCK 通路抑制劑Y-27632 預處理）；在造模手術前1 h 抑制劑組大鼠尾靜脈注射Y-27632（5 mg/kg），其他組大鼠輸注等量的生理鹽水。

模型組、抑制劑組大鼠參照文獻[7]的方法制備CME 模型，具體如下：將各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定在無菌操作臺上。將其與小動物呼吸機經喉氣管插管法連接，待大鼠呼吸性征平穩后，在大鼠胸左緣肋間備皮開胸，逐層分開，至心臟和主動脈暴露，使用血管夾夾閉10 s升主動脈，同時使用小動物微量注射器從大鼠左心室心尖處向左心室內注入42 μm 微栓塞球（100 ml，約3 000 個，凍干粉，挪威Dyno 公司）以建立CME 大鼠模型。待大鼠心率正常后關胸，等其自主呼吸無障礙后拔出氣管插管，術畢注射青霉素防止感染；假手術組左心室心尖處注入100 ml 生理鹽水，其他操作均相同。

1.3 超聲心動圖檢測各組大鼠的心功能

造模以后常規飼養，12 h 后結束實驗，開始進行彩色多普勒超聲心動圖檢測，腹腔注射2%異氟烷誘導麻醉后，仰臥位固定，彩色多普勒超聲心動圖檢查各組大鼠的心臟功能。檢測左心室舒張末期容積（LVEDV）、心排血量（CO）、左心室短軸縮短率（LVFS）及左心室射血分數（LVEF）。

1.4 HE、HBFP 染色觀察各組大鼠心肌組織病理學改變

超聲心動圖檢查完畢后，將大鼠麻醉處死，開胸取出心臟，剔除其心房及心臟周圍組織，將90%的心室部分迅速以液氮封存轉入深冷冰箱待測，10%的心室部分，制成切片，進行HE、HBFP 染色，光鏡下記錄圖像，并采用Leica Qwin3.4 圖像統計軟件通過平面法測量壞死區域，大鼠的微梗死缺血面積等于壞死的切片面積與縱切片面積的百分比值。

1.5 TUNEL 染色檢測各組大鼠心肌細胞的凋亡

從冰箱中取出10%大鼠心室組織，常規方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗兩次，梯度酒精浸洗5 min，風干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3 次，每次3 min，然后4℃預冷乙醇上進行如下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS 漂洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡進行觀察。

1.6 JC-1 法檢測各組大鼠心肌細胞線粒體膜電位變化

取10%心肌組織，加入裂解液，超聲裂解30 s，按照線粒體提取試劑盒在0～4℃下提取心臟組織線粒體，之后嚴格按照線粒體膜電位試劑盒操作，并使用Image-Pro P lus 6.0 軟件分析圖像，以紅色熒光/綠色熒光強度的比值來表示心肌細胞的線粒體膜電位[8]。

1.7 Western blot 檢測各組大鼠心肌組織中凋亡蛋白Bax、Bcl-2 以及與信號通路相關蛋白p-RhoA、ROCK1、ROCK2 的表達水平

從冰箱中取出10%大鼠心肌組織，采用常規方法提取總蛋白，經BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，準確量取50 μg，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），結束后，將樣品蛋白經濕轉法轉至PVDF 轉膜上，加入10%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗（Bax、Bcl-2、p-RhoA、ROCK1、ROCK2）并且以（1:1 500）比例進行稀釋，維持4℃過夜孵育，洗滌加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗孵育3 h，增強化學發光ELC 顯色30 min，經曝光、顯影、定影后，以GAPDH 為內參來表示蛋白的表達水平。

1.8 統計學方法

本研究中的實驗采用SPSS 16.0 軟件進行數據統計，采用Graphpad5.01 作圖，獲得實驗數據中符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，當P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 彩色多普勒超聲心動圖檢測大鼠心功能的變化（圖1A，圖1B）

圖1 三組超聲心動圖檢測（1A）及各組大鼠的LVEF、FS、CO 及LVEDV 比較（1B）（x，n=20）

彩色多普勒超聲心動圖檢測各組大鼠心功能結果：與假手術組相比，模型組和抑制劑組大鼠的LVEF[（81.35±1.86）% vs.（46.71±5.63）%vs.（65.05±2.68）%，P＜0.05]、CO[（0.23±0.026）L/min vs.（0.03±0.02）L/min vs.（0.14±0.03）L/min，P＜0.05]、FS[（57.64±1.29）% vs.（26.35±3.34）%vs.（42.07±1.28）%，P＜0.05]明顯降低，LVEDV[（5.68±0.21）mm vs.（7.36±0.14）mm vs.（6.45±0.17）mm，P＜0.05]明顯升高；與模型組相比，抑制劑組大鼠LVEF、CO、FS 明顯升高，LVEDV 明顯降低，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠心肌組織病理學改變（圖2A，2B）

圖2 各組大鼠心肌組織病理學改變（2A）及各組大鼠缺血心肌面積比率（2B）

HE 染色結果顯示，心肌細胞胞漿染成均勻的紅色，胞核呈現藍色。假手術組大鼠心肌細胞結構完整，清晰可辨，細胞整齊排列，動脈微血管無異常病變。模型組大鼠肌細胞排列紊亂，部分核膜破裂，消失，可見部分細胞胞膜缺失，動脈微血管中可見大量微栓塞球填充，大量炎性細胞浸潤；抑制劑組大鼠心肌細胞較模型組排列規整，炎性細胞浸潤明顯減少，微栓塞球填充明顯減少。

HBFP 染色結果顯示，胞核呈現藍色，正常心肌組織呈現黃色或黃棕色，缺血心肌呈現紅色。假手術組大鼠心肌細胞未見明顯的微梗死病灶，模型組、抑制劑組大鼠可見多處微梗死病灶，主要分布在左心室內膜層，微梗死病灶呈現明顯的紅色。統計結果顯示：與假手術組相比，模型組和抑制劑組大鼠缺血心肌面積比率明顯升 高[（0.00±0.00）% vs.（15.55±2.67）% vs.（8.72±2.49）%，P＜0.05]；與模型組相比，抑制劑組大鼠缺血心肌面積比率明顯下降（P＜0.05），差異均有統計學意義。

2.3 各組大鼠心肌組織中的細胞凋亡（圖3A、3B）

圖3 缺口末端標記（TUNEL）染色檢測各組心肌組織中的細胞凋亡（3A）及各組心肌細胞凋亡率（3B）

TUNEL 染色結果顯示，正常心肌細胞核呈現淡藍色，凋亡細胞核呈現棕黃色。假手術組大鼠心肌呈現均勻的淡藍色，未見棕黃色細胞核，與假手術組相比，模型組和抑制劑組大鼠心肌棕黃色細胞的數量明顯增多，心肌細胞凋亡率[（3.35±1.22）%vs.（76.87±6.95）% vs.（43.66±3.82）%，P＜0.05]明顯升高，與模型組相比，抑制劑組大鼠心肌棕黃色細胞的數量明顯減少，細胞凋亡率明顯降低，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠心肌組織中的凋亡相關蛋白的相對表達（圖4A，4B）

圖4 免疫印跡法檢測Bcl-2 和Bax 的表達（4A）及各組Bax 及Bcl-2 的相對表達（4B）

Western blot 檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組和抑制劑組大鼠心肌細胞中Bcl-2 的表達[（0.99±0.08）vs.（0.33±0.19）vs.（0.97±0.08），P＜0.05]明顯降低，Bax的表達[（0.83±0.20）vs.（4.56±0.65）vs.（2.23±0.22），P＜0.05]明顯升高，差異均有統計學意義；與模型組相比，抑制劑組大鼠心肌細胞中，Bcl-2 的表達明顯升高，Bax 的表達明顯降低（P均＜0.05），差異均有統計學意義。

2.5 JC-1 法各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位（圖5A，5B）

圖5 各組大鼠心肌細胞的線粒體膜電位（5A）及各組紅色熒光及綠色熒光比值（5B）

染料JC-1 通過發射熒光從綠轉變到紅來展現線粒體的膜電位的變化，本研究中JC-1 染色結果，假手術組大鼠心肌細胞被JC-1 染色后呈現紅色熒光，與假手術組相比，模型組和抑制劑組大鼠心肌細胞綠色熒光強度明顯增強，紅色熒光與綠色熒 光 比 值[（96.22±9.35）% vs.（31.63±10.90）%vs.（63.55±9.69）%，P＜0.05]明顯下降；與模型組相比，抑制劑組大鼠心肌細胞綠色熒光強度明顯減弱，紅色熒光有所增強，紅色熒光與綠色熒光比值明顯上升，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

2.6 Western blot 檢測各組大鼠心肌組織中p-RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白的表達水平（圖6A，6B）

圖6 各組大鼠心肌組織p-RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白的表達（6A）及各組p-RhoA、ROCK1、ROCK2 蛋白的相對表達（6B）

Western blot 結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織p-RhoA[（0.97±0.05）vs.（4.78±0.26），P＜0.05]、ROCK1[（0.98±0.08）vs.（4.28±0.23），P＜0.01]、ROCK2[（1.06±0.09）vs.（4.57±0.19），P＜0.05]蛋白的表達明顯升高，差異均有統計學意義；與模型組相比，抑制劑組大鼠心肌組織p-RhoA[（4.78±0.26）vs.（2.11±0.13），P＜0.05]、ROCK1[（4.28±0.23）vs.（2.46±0.37），P＜0.05]、ROCK2[（4.57±0.19）vs.（2.29±0.11），P＜0.05]蛋白的表達明顯下降，差異均有統計學意義。

3 討論

急性冠狀動脈綜合征溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療（PCI）過程中常伴有CME 的發生。CME 的出現常常造成患者心律失常、冠狀動脈儲備減少以及不可逆的心肌損傷，尤其是CME 中伴有的“無復流”、“慢血流”嚴重影響患者的心臟功能以及預后，甚至危及生命[9]。目前尚無有效的根治性治療手段。研究表明[10]左心室心肌細胞異常凋亡是CME 發生的主要因素。因此研究CME 中左心室心肌細胞的凋亡機制對臨床治療具有重大意義。

心臟是能量消耗較高的器官，線粒體是細胞進行能量代謝的場所。研究表明[11]心臟能量代謝失常是心肌細胞凋亡的始動事件。線粒體膜電位的下降是心肌細胞早期凋亡的標志性事件。抗凋亡蛋白Bcl-2 與促凋亡蛋白Bax 的比值降低是啟動線粒體凋亡途徑的開關。Liu 等[12]研究報道CME 后心肌細胞Bcl-2 的表達減少，Bax 的表達增加，心肌細胞凋亡率升高。He 等[13]研究證實在對CME 大鼠進行抗細胞凋亡干預后，明顯改善了大鼠的心功能以及減小其心臟發生微梗死的面積。Liang 等[14]研究證實改善CME 大鼠的線粒體功能，調控Bcl-2 與Bax的表達比值，提高其線粒體膜電位，恢復心肌細胞線粒體的能量代謝過程，能明顯降低心肌細胞的凋亡率，CME 后的心肌的能量代謝障礙有助于心功能的恢復。本研究通過構建CME 模型發現，模型組大鼠心臟超聲心動圖明顯觀察到心功能下降，HE、HFBP 切片后可明顯觀察到心肌血管微栓塞以及心肌組織微梗死病灶，說明CME 造模成功。模型組大鼠心肌凋亡率明顯升高、線粒體膜電位明顯下降、抗凋亡蛋白Bcl-2 表達減少以及促凋亡蛋白Bax 表達增加，與既往研究結果相符。

RhoA/ROCK 通路是機體內重要的信號通路，Rho 是小分子G 蛋白的成員之一，常作為信號轉導的分子開關，直接參與調控細胞形態維持、細胞粘附與遷移、平滑肌收縮等多種細胞生物效應[15]。ROCK 主要包括ROCK1 和ROCK2 兩種亞型，是RhoA 下游最重要的效應器，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。研究表明[16]ROCK 的兩種亞型在氨基酸序列的一致性為65%，在激酶結構域的相似性為92%，ROCK 在腦、肌肉以及心臟組織等組織中廣泛存在，ROCK1 主要在維系心肌細胞骨架結構中發揮重要作用，ROCK2 則具有調控心肌細胞收縮、黏附與分裂的作用。Seccia 等[17]臨床研究表明RhoA/ROCK 通路與冠狀動脈的病變密切相關。實驗數據證明[18]抑制RhoA/Rho 通路后，ROCK 的轉錄功能降低，能夠明顯抑制心肌細胞的凋亡，改善慢性心衰大鼠的左心室重構。Cui 等[19]研究證實對缺血再灌注大鼠進行法舒地爾（RhoA/ROCK 通路抑制劑）治療后，其線粒體功能明顯恢復，心臟的能量代謝和心功能明顯改善。但尚未見RhoA/ROCK 通路在CME 的作用機制的報道。本研究中用RhoA/Rho 激酶信號通路抑制劑Y-27632 來觀察RhoA/Rho 信號通路在CME 的作用。結果發現抑制劑組大鼠心功能明顯好轉，組織病理明顯改善，心肌細胞的凋亡率明顯降低，線粒體膜電位明顯上升，Bcl-2 的表達增加，Bax 的表達減少，而western blot 結果表明與假手術組相比，模型組大鼠心肌中p-RhoA、ROCK1、ROCK2 水平出現明顯的升高；與模型組相比，抑制劑組大鼠心肌中p-RhoA、ROCK1、ROCK2 水平出現明顯的下降，表明CME 激活RhoA/ROCK 通路，抑制RhoA/ROCK 通路，能明顯改善CME 大鼠癥狀。

綜上所述，CME 激活RhoA/ROCK 通路，抑制RhoA/ROCK 通路能明顯降低心肌的凋亡率，改善CME 大鼠心功能。但是就是否還有其他通路參與這一過程以及如何將RhoA/ROCK 通路的抑制作用應用到臨床上的CME 治療中還需要進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突