CCL2在骨肉瘤組織中的表達及其臨床意義

鞏潤澤，胡海燕

上海交通大學附屬第六人民醫院腫瘤內科，上海 200233

骨肉瘤是一種來自于骨的原發惡性腫瘤，占骨原發腫瘤的56%，發病率約為3/105，發病年齡在10～14歲［1-3］，臨床表現以患處的疼痛、腫脹以及病理性骨折為主。大多數骨肉瘤患者只存在單一病變，最常見的是肢體骨肉瘤，尤其是股骨遠端，其他常見部位依次是近側脛骨的干骺端和肱骨近端、頭頸部、脊柱及骨盆。值得注意的是，近10%～20%的患者因轉移灶被確診。常見的部位是肺（85%），其次是骨骼（8%～10%），偶爾也有淋巴結［4］。其余80%～90%的患者可考慮具有亞臨床轉移或微轉移，目前無法準確檢測［5］。手術聯合大劑量、密集、多藥序貫化療為骨肉瘤標準治療方法，與單純手術治療相比，患者的保肢率、生存率獲得了大幅提高［6］。然而，伴有轉移的患者生存率仍不容樂觀［7］。腫瘤微環境與腫瘤轉移密切相關，CC族趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2）是一種與腫瘤密切相關的趨化因子，通過識別CC族趨化因子受體2（CC chemokine ligand receptor 2，CCR2），調節免疫細胞向腫瘤的遷移［7］。轉移相關的巨噬細胞在細胞表面表達高水平的CCR2。CCL2與CCR2的結合促進巨噬細胞招募到轉移位點，從而加速癌細胞的播散和擴張。CCL2可以增加乳腺癌、腸癌、肺癌等腫瘤的轉移和侵襲性［8-10］。本研究在單細胞測序分析骨肉瘤微環境時發現骨肉瘤細胞高表達CCL2，進而通過組織芯片分析CCL2表達與預后的相關性。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集上海交通大學附屬第六人民醫院腫瘤內科2017年1月—2019年12月收治的11例骨肉瘤患者手術切除的骨肉瘤組織和80例（90例的組織芯片，10例因有組織脫落未納入分析）采用骨肉瘤原發灶石蠟包埋組織制備的組織芯片。本研究為回顧性分析，經上海交通大學附屬第六人民醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 單細胞測序

應用GEXSCOPE?組織解離液［新格元（南京）生物科技有限公司］將11例骨肉瘤組織解離成單細胞懸液，使用鉻控制器（美國10x Genomics公司）將單個細胞封裝成乳狀液滴。使用美國10x Genomics公司的試劑盒（Chromium Single Cell Gene Expression Kit、Gel Bead Kit及Multiplex Kit）并按照說明書構建單細胞RNA測序（single cell RNA sequence，scRNA-seq）文庫。在ChromiumTM控制儀中將細胞分成乳狀液中的凝膠珠，裂解細胞并進行RNA條形碼反轉錄。利用Nextera XT DNA sample Pre-Kit（美國Illumina公司）擴增的cDNA構建測序文庫，并使用高靈敏度DNA試劑盒在安捷倫生物分析儀（美國Agilent Technologies公司）上評估個體樣本的最終文庫。在Illumina HiSeq X測序平臺上收集75個周期運行試劑盒進行測序，每個試劑盒具有150 bp的配對端reads。使用Read10×()函數對具有個體樣本基因表達數據的Seurat對象進行處理。對于每個樣本，將基因表達量表示為該基因的百分數乘以10000，轉換為自然對數，加1后歸一化，避免取對數0。從歸一化表達矩陣中篩選出前3000個高變異基因，居中并按比例進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。基于前50個PCA成分，采用R Harmony軟件包（1.0版）消除批處理效果。

1.3 免疫組織化學檢測

免疫組織化學檢測采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（strept-avidin-biotinperoxidase complex，SABC）法進行染色，步驟參考試劑盒說明書。兔抗人CCL2抗體（ab8101，英國Abcam公司）濃度為1∶100，山羊抗兔二抗濃度為1∶500。免疫組織化學試劑盒及二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，CCL2為細胞質陽性。免疫組織化學評分=染色強度評分×陽性區染色比例評分。

顏色強度：不著色0分，弱著色1分，中著色2分，強著色3分。陽性細胞百分率0～5%計0分，陽性率6%～25%計1分，陽性率26%～50%計2分，陽性率51%～74%計3分，陽性率≥75%計4分。陽性染色主要位于腫瘤細胞的細胞質中。最終結果以染色強度和染色范圍評分的乘機表示：陰性為0分，弱陽性為1～4分，陽性為5～8分，強陽性為9～12分，取中位值分為高表達組＞5.97分，低表達組≤5.97分。

1.4 統計學處理

采用SSPS 22.0軟件進行數據分析。計量資料數據以x±s表示，以CCL2蛋白表達的免疫組織化學評分中位數劃分定義高、低表達組，以患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期及復發作為協變量，進行多因素方差分析（COX回歸分析）。Kaplan-Meier法計算生存率，差異性分析采用 log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單細胞分析骨肉瘤細胞CCL2表達

基于R Harmony與Louvain算法我們定義了骨肉瘤的腫瘤細胞，將測序數據植入Seurat包的“FindClusters”函數后，用t-SNE方法在二維地圖上顯示識別出的聚類，閾值設定為3，CCL2呈高表達（圖1）。

圖1 單細胞分析11例骨肉瘤細胞CCL2表達Fig.1 Single cell analysis of CCL2 expression in 11 samples of osteosarcoma cells

2.2 骨肉瘤組織中CCL2的表達與臨床病理特征分析及免疫組織化學檢測

CCL2表達高低與骨肉瘤患者臨床病理學特征分析結果見表1，CCL2的表達評分與患者的年齡、性別、腫瘤大小、化療壞死率、病理學類型間差異均無統計學意義（P＞0.05），但與臨床分期及有無轉移之間差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 骨肉瘤組織中CCL2的表達與臨床病理特征分析Tab.1 The correlation between CCL2 expression and clinical features of osteosarcoma patients

根據免疫組織化學結果的評分標準將80例骨肉瘤原發灶的組織芯片評分按方法描述的公式計算出來并取中位值，患者被分為低表達組和高表達組（5.29±0.95vs11.45±4.24）（圖2）。

圖2 免疫組織化學SABC法分析骨肉瘤組織CCL2表達Fig.2 Immunohistochemical analysis of CCL2 expression in osteosarcoma by SABC method

2.3 生存分析

本研究的隨訪時間為12～36個月，80例患者中31例因死亡而終止隨訪，其余患者至終點時仍生存。經Kaplan-Meier生存統計分析結果顯示，CCL2高表達組患者的總生存率較低表達組患者組低（P=0.042，圖3）。

圖3 Log-rank檢驗分析骨肉瘤組織CCL2表達與生存率分析Fig.3 Analysis of CCL2 expression and survival rate in osteosarcoma by log-rank test

3 討論

骨肉瘤的發生率呈雙峰分布模式：在10～ 14歲（青春期發育階段）出現第一次發病高峰，然后在60歲后出現第二次發病高峰。骨肉瘤的病因尚不清楚，基因組異質性高，目前尚未找到驅動基因，報告較多的突變基因包括定位于染色體13q14的Rb基因和定位于染色體17p13的p53基因。在20世紀70年代，骨肉瘤的標準治療方式是截肢，但5年生存率＜20%。20世紀80年代大劑量化療藥物引入術前新輔助和術后輔助化療使骨肉瘤患者的5年生存率提高到65%～70%。但伴發轉移的患者5年生存率仍然≤25%［11］。

骨肉瘤細胞與周圍腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）之間的交流是腫瘤生長和隨后轉移所必需的。TME的主要影響成分是腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM），它是參與炎癥反應和組織穩態的免疫細胞。我們前期應用單細胞技術分析了骨肉瘤組織及免疫微環境的異質性［12］，結果發現，骨肉瘤細胞CCL2高表達。與原發性骨肉瘤相比，在肺轉移瘤中發現了更高比例的M2型TAM，這與促炎分子導致腫瘤侵襲能力增加有關。TAM尤其是M2型TAM的浸潤增加長期以來一直與各種腫瘤，包括骨肉瘤預后不良有關［13］。CC族趨化因子是趨化因子超家族中的一個亞家族（包括4個小鼠源趨化因子CCL6、CCL9、CCL10和CCL12），是細胞間信號轉導的組成部分，對腫瘤微環境的功能至關重要。在大多數實體瘤中，這突出了其在癌組織中作為潛在的診斷和預后生物標志物的價值。許多CC族趨化因子是多種受體的配體，CCL2即單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），其受體包括CCR1、CCR2、CCR3、CCR4和CCR5，募集單核細胞包括巨噬細胞、嗜堿性粒細胞、T細胞和NK細胞。但不同的腫瘤組織內CCL2的作用不同，在乳腺癌、多形性膠質母細胞瘤中，CCL2是預后不良指標［14］。腫瘤細胞CCL2的表達可能在生長因子、放療、缺氧及化療的刺激下分泌增加。由腫瘤細胞分泌的CCL2還通過激活細胞外信號轉導通路提高腫瘤細胞自身的侵襲能力，促進腫瘤細胞遷移［15］。CCL2還能通過其受體CCR2介導TAM和骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）進入腫瘤區，CCL2也是M2型巨噬細胞極化的因素之一。它還可以招募CCR2表達的Treg亞群［16］、輔助型T細胞 Th17［17］。Qian等［18］使用小鼠乳腺癌骨轉移模型對CCL2進行研究，結果發現，CCL2會有效地募集炎癥單核細胞，進而促進小鼠乳腺癌骨轉移。Wang等［19］對268例非轉移性透明細胞腎細胞癌患者術后取得的組織芯片進行CCL2免疫組織化學染色并評分，然后結合患者的生存信息進行預后分析，結果發現，CCL2高表達患者的10年生存率要明顯低于CCL2低表達患者。本研究采用免疫組織化學染色的方法檢測了骨肉瘤組織芯片的CCL2表達情況，結果發現，高表達CCL2的患者3年生存率低于低表達組患者，CCL2表達與臨床分期及遠處轉移密切相關。本研究和上述其他瘤種的研究一致，表明腫瘤細胞可以分泌CCL2，募集以巨噬細胞為主的單核細胞，促進腫瘤的轉移。

總之，CCL2在骨肉瘤轉移的過程中起著重要作用，對預測骨肉瘤患者預后有著重要的意義。本研究結果顯示，CCL2與骨肉瘤肺轉移密切相關，但具體機制仍有待進一步研究。