microRNA-520a靶向MCM3抑制急性淋巴細胞白血病細胞增殖的研究*

張 歡，張國君

(中國醫科大學附屬盛京醫院第一血液內科，沈陽 110022)

成人急性淋巴細胞白血病(ALL)是一類以原幼淋巴細胞惡性增殖、分化障礙、凋亡受阻為特點的血液系統惡性腫瘤[1-2]。miR-520a在多種惡性腫瘤中表達下調并發揮抑癌基因功能[4-7]，但其在急性淋巴細胞白血病的表達及意義國內外尚少見報道。同時MCM3基因在白血病、淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等腫瘤中過度表達，且與腫瘤的生長、侵襲及轉移相關[8-11]。MCM3是miR-520a的可能靶基因，目前尚少見miR-520a調控MCM3的相關報道。本研究通過檢測急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)組織、細胞中miR-520a 調控MCM3的表達及對細胞增殖的影響，以期為B-ALL的臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

人急性B淋巴細胞白血病細胞株(BALL-1)購于北京北納創聯生物技術研究院；健康人外周血B淋巴細胞來自健康志愿者外周血。細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基(美國Hyclone公司)在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

1.1.2骨髓標本

選取2018年1月至2019年12月本院初診B-ALL患者30例,所有患者均為原發、無轉移、未經過任何化療的初次病患。該研究通過本院倫理委員會批準(2018PS231)，并經患者知情同意后進行。20例非惡性血液病患者骨髓組織作為對照。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞轉染

將對數生長期的細胞接種于6孔板中，培養過夜后采用lipofectamine 3000作為轉染試劑，按照說明書進行轉染。轉染12 h觀察細胞狀態并更換新鮮培養基。miR-520a mimics、miR-520a inhibitor和miR-520a NC均購自上海吉瑪生物有限公司。空載體pCDNA3.1和pCDNA3.1-MCM3野生型質粒購自上海吉凱基因生物技術有限公司。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR)

使用TRIzol法分別提取各組細胞RNA，使用miRNA 逆轉錄試劑盒取0.2 μg逆轉錄成cDNA，使用miRNA qRT-PCR TB Green?試劑盒和相應引物通過qPCR儀進行擴增檢測，結果數據采用2-ΔΔCt方法分析。以U6為內參，計算miR-520a相對表達水平。

1.2.3Western blot

收集各組細胞后，使用RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，加MCM3(Abcam兔抗人,1∶1 000)和β-actin(Abcam兔抗人,1∶2 000)一抗4 ℃過夜。次日TBST洗膜3次后二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，1∶5 000)37 ℃孵育1 h；洗膜后ECL顯影，使用Image J軟件以β-actin為內參進行條帶灰度分析。

1.2.4CCK-8測細胞增殖能力

取對數生長期的細胞，接種于96孔板(2×104個/mL)，每組設5個平行孔。12 h后，進行細胞處理實驗并觀察細胞，實驗結束后,以1 000 r/min離心10 min，棄上清液每孔加入10 μL CCK-8試劑和100 μL的PBS溶液，于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續培養2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長下的吸光度(A)值。細胞增殖率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.2.5miR-520a靶基因預測

使用TargetScan(http://www.targetscan.org/)網站預測MCM3是miR-520a可能的目標靶基因，并找到他們之間的作用位點進行實驗驗證。

1.2.6雙螢光素酶報告系統

化學合成包含有與miR520a互補結合的靶基因MCM3 3′-UTR序列片段和突變的MCM3 3′-UTR，細胞接種24孔板(2×104個/mL),待細胞生長達到60%融合后進行轉染。轉染分為miR-520a mimics+空載體組、miR-520a mimics+3′-UTR野生型組、miR-520a mimics+3′-UTR突變型組，設3個復孔。轉染后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 miR-520a在B-ALL患者骨髓淋巴細胞和BALL-1中的表達

結果顯示，miR-520a在非惡性血液腫瘤患者骨髓淋巴細胞的表達水平顯著高于其在B-ALL患者骨髓淋巴細胞中的表達(圖1A)，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-520a在健康人外周血淋巴細胞中的表達水平顯著高于其在BALL-1細胞系中的表達(圖1B)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 miR-520a能夠參與調控B-ALL細胞的增殖

向BALL-1細胞中分別轉染miR-NC和miR-520a mimics，檢測轉染48 h后各組的BALL-1細胞增殖能力。與miR-NC組比較，miR-520a mimics組BALL-1細胞的增殖活力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 miR-520a靶向MCM3基因mRNA 3′-UTR

Targetscan網站生物信息學預測顯示，MCM3基因mRNA 3′-UTR中含有與miR-520a互補的核苷酸序列，見圖3A；雙熒光素酶報告基因檢測顯示，與miR520 mimics+空載體組比較，miR-520 mimics+3′UTR野生型組的熒光活性顯著降低(P<0.05),miR-520 mimics+3'UTR突變型組的熒光活性無顯著變化(圖3B、C)。

為了進一步證實MCM3是miR-520a的靶基因，使用miR-520a mimics BALL-1細胞。Western blot結果顯示在miR-520a mimics組的MCM3蛋白表達顯著低于在miR-NC組的表達(圖3D)。

A：miR-520a在非惡性血液腫瘤患者骨髓淋巴細胞(Normal lymphocyte)和B-ALL患者骨髓淋巴細胞中的表達比較；B：miR-520a在健康人外周血淋巴細胞(PBL)和BALL-1中的表達比較;a：P<0.05。

2.4 MCM3過表達能夠逆轉miR-520a mimics調控BALL-1細胞增殖的作用

與miR-NC組相比，miR-520a mimics組BALL-1中MCM3的蛋白表達顯著降低(圖4A)，且miR-520a mimics組BALL-1細胞增殖活力顯著降低(圖4B)，差異有統計學意義(P<0.05)；與miR-520a mimics+pCDNA3.1組對比，miR-520a mimics+MCM3-WT組BALL-1細胞中MCM3蛋白表達水平顯著升高(圖4A)，miR-520a mimics+MCM3-WT組BALL-1增殖活力顯著增加(圖4B)，差異有統計學意義(P<0.05)。

A：miR-520a mimics轉染BALL-1后miR-520a的表達水平變化；B：miR-520a mimics轉染BALL-1后細胞增殖率與miR-NC組比較；a：P<0.05。

A：通過Targetscan軟件分析miR-520a靶向MCM3基因mRNA 3′-UTR及作用位點；B、C：雙螢光素酶報告基因系統檢測miR-520a與MCM3的3′-UTR結合情況；D：miR-520a mimics轉染后MCM3的蛋白變化；a：P<0.05。

A：對照組和實驗組中MCM3蛋白表達水平；B：對照組和實驗組細胞增殖能力變化；1：miR-NC組；2：miR-520a mimics組；3：miR-520a mimics+pCDNA3.1組；4：miR-520a mimics+MCM3-WT組；a：P<0.05。

3 討 論

腫瘤的發生、發展常與腫瘤細胞生物學特征的改變密切相關。大量研究顯示，腫瘤細胞的惡性增殖是腫瘤形成及發展的關鍵機制。目前研究顯示，人體中有許多miRNA在腫瘤中起著類似原癌基因或者抑癌基因的作用[12]。現已發現miR-520a在乳腺癌、結腸癌、胃癌、骨肉瘤、肝癌等實體腫瘤均表現出抑癌因子的特征[13-17]。且miR-520a在慢性粒細胞白血病中能夠抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[18]。

本研究以成人B-ALL患者為研究對象，分析miR-520a在B-ALL群體中的表達特點，結果顯示成人B-ALL患者骨髓淋巴細胞和BALL-1細胞系中miR-520a表現明顯低表達水平，提示miR-520a的表達異常與BALL的發生、發展存在一定相關性。這與miR-520a在卵巢癌和乳腺癌中的低表達相一致，miR-520a在這兩種癌癥中也表現出低于正常組織的表達水平[19-20]。進一步研究發現，在BALL-1中上調miR-520a的表達可以促進細胞的增殖，表示miR-520a可能在B-ALL中發揮抑癌基因的作用。這與miR-520a在許多癌癥中發揮的作用是一致的[13-17]。

TargetScan軟件預測結果，miR-520a與MCM3的3′UTR區域存在潛在結合位點。雙熒光素酶報告實驗顯示，僅miR-520 mimics+3′UTR野生型組熒光素酶活性顯著降低，提示miR-520a可能通過直接與MCM3的3′UTR區域結合抑制MCM3的表達，且在BALL-1細胞中過表達miR-520a，能夠顯著下調MCM3的蛋白表達水平。為了進一步證實miR-520a對MCM3的靶向調控作用，在miR-520a過表達組中過表達MCM3蛋白，發現MCM3過表達能夠逆轉miR-520a mimics調控BALL-1細胞增殖的作用。這表明miR-520a是通過抑制靶基因MCM3的表達參與調控BALL-1細胞的增殖過程。在肝癌中MCM3高表達并與患者的不良預后呈正相關，可以作為一個肝癌進展的標志物[21]。MCM3的高表達提示結直腸癌預后不良，并促進G1/S細胞周期的進展、增殖、遷移和侵襲[22]。基因表達譜分析顯示MCM3能反映浸潤性導管癌患者的預后[10]。高表達水平的磷酸化MCM3能夠促進腎癌細胞增殖和抑制凋亡[23]。這些都揭示了MCM3在惡性腫瘤中的促癌作用，與MCM3在B-ALL中的促癌作用相一致。

綜上所述，本研究初步探討了miR-520a在B-ALL中的作用及機制，驗證了miR-520a靶向調控MCM3的表達對BALL-1細胞增殖的影響，為B-ALL的分子靶向治療提供理論依據。然而，由于miRNA-靶基因調控的多樣性，關于miR-520a抑制B-ALL的生物學特征是否通過其他作用方式和信號通路，還需要進一步研究驗證。