PBMCs宮腔灌注對PCOS患者凍融胚胎移植周期妊娠結局的影響*

劉 聰，李偉偉，殷秀榮

(河北省秦皇島市婦幼保健院生殖醫學科 066000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)對育齡期女性的生育功能有重要影響[1-2]。因不排卵和卵母細胞質量差，PCOS患者大多需要促排卵治療，部分患者需要通過輔助生殖技術獲得妊娠，但PCOS患者因存在高雄激素血癥、胰島素抵抗等內分泌代謝異常，會通過多種途徑導致子宮內膜容受性下降，流產率升高[3]。

宮腔灌注外周血單個核細胞(PBMCs)可使宮腔內發生有利于胚胎侵入的炎性反應，其分泌的細胞因子在胚胎著床、維持妊娠中可能發揮關鍵作用[4]。近年來的研究提示，與人絨毛膜促性腺激素(HCG)共培養的PBMCs可促進滋養細胞的浸潤[5-6]。本文旨在探討PCOS患者凍融胚胎移植(FET)周期應用HCG共培養PBMCs宮腔灌注對子宮內膜容受性相關細胞因子的表達及對臨床妊娠率、流產率的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年1月至2019年12月在本院生殖醫學科行FET的PCOS為研究對象。納入標準：(1)符合PCOS的鹿特丹診斷標準[7]；(2)年齡20～35歲；(3)宮腔鏡檢查未見異常；(4)行IVF/卵胞漿內單精子注射(ICSI)助孕，有冷凍胚胎。排除標準：(1)合并甲狀腺功能異常、腎上腺功能異常、高泌乳素血癥、糖尿病等其他內分泌疾??；(2)合并消化系統、呼吸體統、泌尿系統、心血管系統等全身性疾??；(3)合并子宮畸形、子宮內膜息肉、子宮黏膜下肌瘤、宮腔粘連等子宮器質性病變；(4)有染色體異常、活動期傳染病。本研究共納入PCOS患者382人，年齡20～35歲。本研究符合臨床操作規范，通過醫院醫學倫理委員會審核批準，所有研究對象均簽署知情同意書后入組。

1.2 內膜準備方法

研究對象采用隨機數字表法分為試驗組(192例)和對照組(190例)。所有入選患者選擇誘導排卵方案準備內膜，于月經第2～5天給予來曲唑(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字：H19991001)2.5 mg，口服，共服藥5 d。從月經第10天開始監測卵泡發育情況直至排卵，期間依據卵泡監測情況適時添加人絕經期尿促性腺激素(HMG，麗珠集團麗珠制藥廠)促進卵泡發育。卵泡直徑≥18 mm或雌激素達734 pmol/L、內膜厚度≥7 mm時，依據血黃體生成素(LH) 情況肌肉注射HCG(麗珠集團麗珠制藥廠)10 000 U誘導排卵。LH<20 mU/mL，于21:00肌肉注射HCG，以隔日為第0天；LH≥20 mU/mL，于14:00～16:00肌肉注射HCG，以次日為第0天，于第3天行胚胎移植。

1.3 自體PBMCs分離及HCG共培養

應用經陰道超聲動態監測卵泡發育情況，于排卵前3～5 d，抽取試驗組研究對象外周血30 mL，應用外周血淋巴細胞分離液，通過聚蔗糖-泛影葡胺梯度法分離PBMCs，置于RPIM1640培養基(美國Sigma公司)及10%血清清蛋白中與HCG(3～6 U/mL，麗珠制藥公司)混合共培養。培養24 h后離心、分離PBMCs，將細胞濃度調整為(1～5)×106個/mL，重懸至500～800 μL于5 mL無菌離心管中備用。

1.4 宮腔液收集及PBMCs宮腔灌注

移植前3 d，對試驗組和對照組的所有研究對象進行宮腔液收集及宮腔灌注。所有患者取膀胱截石位，以0.1%聚維酮碘消毒外陰，0.9%NaCl消毒陰道，移植管(美國Cook公司)置入子宮腔內，宮腔灌注前先用胚胎移植管內芯輕柔抽吸少量宮腔分泌物，約10 μL置于裝有1 mL磷酸鹽緩沖溶液的無菌試管，反復沖洗后置于凍存管中(美國Corning公司)，迅速放入液氮中儲存備檢。試驗組連接1 mL注射器，抽取已制備好的PBMCs，緩慢注入子宮腔內，停留數秒后取出移植管，灌注劑量為0.5 mL，囑患者臥床休息30 min；對照組使用培養液0.5 mL宮腔灌注，灌注方法同試驗組。移植日以同樣方法收集宮腔液待檢。

1.5 觀察指標

1.5.1宮腔液檢測

宮腔灌注前和胚胎移植前收集的宮腔液樣本10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用Bio-Plex懸液芯片系統進行檢測。檢測項目包括嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、調節激活正常T細胞表達分泌因子(RANTES)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內皮生長因子(VEGF)及白細胞介素(IL)-1β、IL-1α、IL-2、IL-10等27種免疫相關的細胞因子。

1.5.2臨床結局隨訪

胚胎移植后14 d檢測血HCG，血HCG>6.2 mU/mL診斷為妊娠，繼續動態監測血HCG變化，血HCG增高明顯者，移植28～30 d行陰道超聲，見孕囊或胎心搏動，診斷為臨床妊娠，記錄胚胎著床情況，并計算著床率、臨床妊娠率、早期流產率、異位妊娠率等臨床指標。著床率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，早期流產率=12周前流產周期數/臨床妊娠周期數×100%，異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 一般資料比較

兩組患者的年齡、不孕年限、BMI、基礎性激素、AMH差異無統計學意義，見表1。

表1 試驗組與對照組的一般資料比較

組別nbE2(pmol/L)bFSH(mU/mL)bLH(mU/mL)AMH(ng/mL)試驗組192138.92±25.986.87±2.768.97±4.925.16±2.34對照組190142.18±22.786.38±2.189.26±5.285.23±3.11t1.3041.9240.5550.249P0.1930.0550.5790.804

2.2 胚胎移植條件及妊娠結局比較

試驗組與對照組比較，移植優胚率、異位妊娠率差異無統計學意義(P>0.05)，而試驗組的著床率、臨床妊娠率顯著高于對照組，早期流產率顯著低于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 試驗組與對照組妊娠結局比較[%(n/n)]

2.3 PBMCs宮腔灌注前后宮腔液細胞因子表達變化

比較PBMCs宮腔灌注前后Bio-Plex懸液芯片包括的27種可能與胚胎著床相關的細胞因子的表達，結果顯示，宮腔灌注后宮腔液中MCP-1、 TNF-α、IL-2的水平較治療前下降，而RANTES、IL-10水平較治療前升高，差異有統計學意義。而對照組，宮腔灌注前后MCP-1、TNF-α、RANTES、IL-2、IL-10水平無顯著變化，見表3。

表3 試驗組與對照組宮腔灌注前后相關細胞因子的表達變化

3 討 論

影響妊娠過程的兩個重要因素為子宮內膜容受性和胚胎質量，其中子宮內膜因素占60%，胚胎因素占40%[8]。子宮內膜容受性的關鍵在于細胞分子水平動態而精準的調控，以促使胚胎植入和妊娠的發生。

PBMCs是指外周血中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞和巨噬細胞。子宮內膜的巨噬細胞、樹突狀細胞及參與適應性免疫的調節性T細胞，為胚胎著床提供獨特的內分泌-免疫微環境，對胚胎定植起到積極作用。2006年，YOSHIOKA等[9]報道了對反復種植失敗(RIF)患者進行PBMCs宮腔灌注，結果顯示臨床妊娠率和活產率均高于對照組。陳雷寧等[10]對3例RIF患者宮腔灌注PBMCs聯合凍融FET，均獲得了足月妊娠，隨訪產婦和新生兒情況未發現異常。研究發現，HCG與PBMCs共培養后PBMCs分泌的細胞因子水平增加、滋養細胞的侵襲能力增強，表明HCG可以加強PBMCs的相關作用[5]?；谝陨涎芯浚茰yPBMCs可能在胚胎著床及妊娠的維持中有積極促進作用且尚未發現對孕產婦及新生兒的不良影響。

PCOS是臨床常見的婦科內分泌疾病，此類患者由于子宮內膜蛻膜化異常[11]、子宮內膜容受性下降影響胚胎著床，導致不良妊娠結局概率明顯升高。因此，積極探索提高PCOS患者的子宮內膜容受性的方法有助于提高PCOS患者的胚胎著床率和臨床妊娠率、降低流產率。PBMCs作為重要的免疫細胞，宮腔灌注后可能通過改變相關細胞因子的表達改變宮腔局部微環境，調控胚胎植入和免疫耐受過程。本研究采用了HCG共培養的PBMCs對FET周期的PCOS患者進行宮腔灌注治療，以期初步探索此方法對改善PCOS患者的妊娠結局的作用。選擇擬行FET的PCOS患者為研究對象的原因在有兩點：需借助IVF/ICSL進行助孕的PCOS患者往往為難治性PCOS患者，更迫切需要一種積極有效的改善妊娠結局的方法獲得妊娠，更能代表需要多種方法聯合治療獲得妊娠的PCOS群體；新鮮周期由于控制性超促排卵的應用，母體內的高雌激素水平會導致子宮內膜種植窗提前出現和關閉，而且影響內膜容受性相關細胞因子的表達，干擾研究結果的分析。

子宮內膜相關細胞因子的表達可通過宮腔鏡下內膜活檢及宮腔液檢測兩種方式進行分析。但宮腔鏡操作屬于有創性操作，患者耐受性、依從性相對較差，且易引起宮腔內出血，影響當周期移植，延長患者治療時間，不易被患者接受。而宮腔液抽吸由專業的生殖醫生進行操作，相對簡單、易行，且方便追蹤隨訪。宮腔液是子宮內一種富含蛋白質的組織營養液，宮腔液中包含子宮內膜的分泌物、血清滲出物、輸卵管液、腹膜液、激活白細胞的釋放液、細胞表面蛋白裂解的可溶性產物，為胚胎發育和植入提供微環境。宮腔液成分在胚胎植入期的免疫抑制和胚胎發育中起重要作用，宮腔液分析可以提供子宮內膜植入前狀態的信息，且研究表明，宮腔液的抽吸不影響同一周期妊娠率?；谝陨显?，本研究在行FET的PCOS患者進行PBMCs宮腔灌注前后檢測宮腔液的細胞因子表達情況。結果顯示，PBMCs宮腔灌注后，試驗組的MCP-1、TNF-α、IL-2水平下降，RANTES、IL-10水平上升，而對照組沒有發生相應的變化。

CD4+T細胞是輔助性T細胞的一類，分為Th1、Th2細胞亞型。Th1細胞介導炎性反應，參與免疫排斥，可分泌TNF-γ、TNF-α、IL-2、IL-12等細胞因子；Th2細胞通過體液免疫，減弱Th1細胞反應，促使免疫耐受形成，可分泌IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子，發揮免疫保護作用。Th1/Th2細胞因子的平衡對調整母胎界面的免疫耐受有重要意義。TNF-α在細胞凋亡和炎癥中起重要作用，復發性流產、早產和子癇前期患者血清、胎盤和子宮內膜中TNF-α及其受體水平升高[12]。MCP-1可募集、趨化、激活巨噬細胞，使TNF-α水平升高，誘發炎性反應，使母體對胎兒抗原產生排斥，是反復流產和反復種植失敗的危險因素[13]。RANTES具有類似封閉抗體的作用，可產生抗父系淋巴細胞的保護性抗體，避免胎兒被母體免疫系統排斥[14]。

對研究對象臨床結局的隨訪顯示，試驗組較對照組的胚胎著床率、臨床妊娠率均升高，早期流產率降低。且治療過程中，所有患者均未出現感染、出血等影響移植的情況，提示嚴格按照標準化流程進行PBMCs宮內灌注及宮腔液抽吸不會對母體造成不良影響，在FET周期中具有可行性，但其對胎兒的遠期影響，比如早產率、出生缺陷率是否會受到影響需進一步追蹤隨訪。

綜上所述，宮內灌注PBMCs可能通過調節MCP-1、TNF-α、RANTES、IL-2、IL-10水平來改善PCOS患者的子宮內膜容受性，是難治性PCOS患者改善妊娠結局的治療方法之一，可為此類患者的治療提供參考。