不同抗凍劑對西伯利亞鱘精子冷凍保存的影響

周 洲，李世凱，趙 飛，陳飛雄，孔 杰

(貴州省農業科學院 水產研究所，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】精子超低溫冷凍保存技術對物種遺傳種質資源保護及苗種生產都具有重要價值。【前人研究進展】目前魚類精子超低溫冷凍保存研究已在日本鱘(Charybdisjaponica)[1]、褐鱒魚(Caspianbrowntrout)[2]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[3]、虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)[4]、大西洋鮭(Salmosalar)[5]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[6]、真鯛(Pagrosomusmajor)[7]等200多種海淡水魚類中有報道。國內外對鱘魚類精子冷凍保存技術開展較多研究的有中華鱘、西伯利亞鱘、史氏鱘、俄羅斯鱘等[8-11]。【本研究切入點】貴州自2012年實現鱘魚全人工繁育以來，受到雌雄魚性腺成熟不同步或地理分布不同產生的生殖隔離導致鱘魚繁殖成功率不高。因此，有必要開展貴州鱘魚精子冷凍保存研究，以提高人工繁殖技術及保存優質良種資源。抗凍劑是影響精子冷凍保存的重要因素[12-13]，但有關抗凍劑對貴州鱘魚精子冷凍保存效果研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】研究不同抗凍劑對西伯利亞鱘精子的冷凍保存效果，以期篩選出合適貴州鱘魚精子的超低溫冷凍保存抗凍劑。

1 材料與方法

1.1 精子采集及活力檢測

1.1.1 精子采集 2019年4-5月，在貴州省水產研究所惠水養殖基地選取性腺發育成熟的鱘雄魚[體長(1.42±0.25)m、體重(15.8±3.5)kg]進行人工催產。精子采集時用干凈的干毛巾擦去體表和生殖孔周圍的水分及污物，用生理鹽水洗凈的塑料軟管輕輕插入生殖孔，用手輕輕擠壓腹部使精液自然流出經導管流入干凈干燥的50 mL離心管中，放置于4 ℃的冰盒中備用。

1.1.2 精子活力檢測 用過濾井水稀釋激活后的精子，在200倍顯微鏡下觀察精子的運動情況，并通過計算機輔助精子分析系統采集相關數據。

1.2 配制精子抗凍劑

稀釋液參照Glogowski等[14]的方法配制，配方為KCl 0.25 mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、蔗糖23.4 mmol/L，pH調到8.5，將相關試劑定溶于1000 mL蒸餾水中，經過0.2 μm過濾除菌待用。然后用稀釋液配置10%、15%及20%的甲醇(MeOH)、二甲基亞砜(DMSO)分別作為抗凍劑，所有試劑均為分析純，試劑配好后放置在4 ℃的冰箱中備用。

1.3 不同抗凍劑處理鱘魚精子活力的測定

將1 mL活力好的鱘魚精液加入凍存管中，以1∶1的比例加入配制好的抗凍劑，使精子的濃度稀釋1倍，混勻后將凍存管放置于4 ℃冰箱平衡20 min后進行液氮冷凍(首先將裝有凍存管的凍存盒置于液氮面以上6 cm處平衡10 min，之后在液氮面2 cm處平衡5 min，最后直接投入液氮中)。解凍時先將其從凍存盒中取出，迅速放入37 ℃水浴鍋中搖晃解凍，至凍存管中沒有小冰塊時停止解凍。用紙巾將凍存管表面的水分擦干，然后用牙簽蘸取少量精液于載玻片上，用吸管滴入1滴過濾井水涂勻，迅速在顯微鏡下(200×)觀察精子的活力，利用計算機輔助精子分析系統(computer-aided sperm analysis, CASA)測定鱘魚鮮精液活力，篩選精子活力高的抗凍劑。精子活力根據直線運動速度分為4個級別：A級精子的直線運動速度大于25 μm/s，B級精子的直線運動速度大于15 μm/s，C級精子的直線運動速度大于5 μm/s，D級精子的直線運動速度為0～5 μm/s。

1.4 不同抗凍劑處理鱘魚精子運動參數的測定

不同抗凍劑凍存的精子經解凍后，用牙簽分別蘸取少量精液于載玻片上，用吸管滴入1滴過濾井水涂勻后，利用計算機輔助精子分析系統分別檢測精子的運動參數，主要包括平均曲線運動速度(curvilinear velocity, VCL)、平均直線運動速度(straight line velocity, VSL)、平均路徑速度(average path velocity, VAP)、精子頭側擺幅度(amplitude of lateral head displacement, ALH)、運動的直線性(linearity, LIN)、運動的擺動性(wobble, WOB)、運動的前向性(straightness, STR)、精子平均鞭打頻率(beat cross frequency, BCF)及平均移動角度(motion average degree，MAD)。同時測定鱘魚鮮精液的運動參數。

1.5 數據處理

利用SPSS19.0對試驗數據進行處理，數據用平均值±標準差表示，采用單因素方差分析檢驗各試驗組精子活力的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 鱘魚精子的活力

從表1看出，鱘魚鮮精A+B級活力精子占93.04%，其中A級精子占58.50%。濃度為10%、15%及20% MeOH保存的精子解凍后，A級活力精子占比均為0，B級低于5%，C級在9.34%～13.91%，而D級最高，在80.78%～88.39%；整體比較，以15% MeOH保存的精子活力較高。濃度為10% DMSO保存的精子解凍后，D級活力精子占比最高，為60.2%，其次是C級，為35.13%,B級僅占4.67%，而A級活力精子占比為0；濃度為15% DMSO保存的精子解凍后，D級活力精子占比最高，為30.26%，A級和C級相差不大，分別為25.37%和24.91%,B級最低，為19.46%；濃度為20% DMSO保存的精子解凍后，D級活力精子占比最高，為43.14%，其次是C級，為27.45%，A級居第3，B級最低，僅占9.8%；整體比較，以15% DMSO保存的精子活力較高。2種抗凍劑相比，不同濃度MeOH保存的A+B級活力精子僅占0～5.31%，平均3.62%；15%DMSO保存的A+B級活力精子占4.67%～44.83%，平均26.30%。表明，DMSO保存的精子活力遠高于MeOH保存的精子。

表1 2種抗凍劑不同濃度處理精子不同活力等級占比

2.2 鱘魚精子的運動參數

從表2看出，不同抗凍劑處理中，鱘魚精子的運動參數DMSO顯著或極顯著高于MeOH。DMSO不同濃度處理中，10%DMSO處理鱘魚精子的運動參數各指標均顯著低于15%DMSO處理和20%DMSO處理。運動參數各指標中，VCL、VSL、VAP、BCF和MAD均以15%DMSO處理最高，分別為24.33 μm/s、13.48 μm/s、22.16 μm/s、12.03 Hz和22.92°，差異均不顯著；ALH、LIN、WOB和SRT均以20%DMSO處理最高，分別為4.09 μm、61.56%、92.31%和66.69%、高于處理，而則低于20%DMSO處理，但差異均不顯著。綜合比較2種抗凍劑處理精子的運動參數，以15%DMSO處理的效果較好。

表2 2種抗凍劑不同濃度處理精子的運動參數

3 討 論

精子的運動特性是判斷精液質量的綜合指標，與其受精能力密切相關，在魚類的生產應用及生殖研究方面具有重要的意義。而由于魚類精子激活后運動速度較快，且持續時間不長，使得常規檢測方法誤差較大，計算機輔助精子分析系統(CASA)是建立在顯微攝像基礎上的計算機精子運動圖像處理的自動分析系統[15-16]，此系統能夠快速準確地測定精子的密度、活率、活力等運動參數，可避免傳統的顯微觀察分析方法因檢測者的個人主觀因素造成檢測結果的誤差，重復性好。如柳凌等[17]利用計算機輔助分析幾種鱘魚凍精激活液對精子活力參數的影響；劉清華等[18]運用計算機輔助分析檢測超低溫保存的真鯛精子質量。本實驗通過計算機輔助分析對西伯利亞鱘魚鮮精及幾種不同抗凍劑保存后的精子運動參數進行測定。

鱘魚鮮精經過濾井水激活后，精子的壽命僅有100s左右，且隨著時間的延長，鱘魚精子的運動速度逐漸變慢，這和胡家會等[19]研究文昌魚精子的運動特征相類似。鱘魚鮮精的VCL為30.31 μm/s,VSL為13.08 μm/s，這與柳凌等[17]利用計算機輔助對西伯利亞鱘凍精激活(10 mmol/L Tris)后精子的VCL為112.96 μm/s,VSL為65.61 μm/s有較大差異[17]，這在一定程度上解釋了實驗所在苗種基地鱘魚人工繁育試驗受精率長期維持在50%左右的原因，因為精子運動速度的快慢直接影響精子的受精率，速度小則減少了精子與卵子接觸的機會。

抗凍劑MeOH 和DMSO被廣泛應用于魚類精子的超低溫冷凍保存中[1-7,20]。在已經報道的鱘魚精子保存研究中，MeOH 和DMSO都可以作為抗凍劑，但是從精子解凍后的活力來看，MeOH要比DMSO好[8,11]。研究結果表明，3種濃度的MeOH抗凍劑精子激活后A級精子均為0，且A+B級精子最高占比僅5.31%。3種濃度的DMSO抗凍劑精子解凍激活后，15%DMSO組A+B級精子占比為44.83%，效果最好。本實驗測定精子的9項運動參數，根據研究報道在鯉魚(Cyprinuscarpio)[22]、文昌魚(Branchiostomabelcheritsingtauensis)[19]、湖鱘(Acipenserfulvescens)[22]及大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[23]等魚類中最重要的精子運動參數為VCL和VSL，15%DMSO組精子的VCL和VSL組均大于其他兩組。同時，15%DMSO組精子的VSL/VCL值為55.40%，大于20%DMSO組精子的VSL/VCL值46.48%，由于VSL/VCL是精子運動軌跡彎曲程度的最好體現，與精子受精率呈正相關[24]，這也說明了幾種抗凍劑保存效果較好的為15%DMSO。抗凍劑DMSO的效果優于MeOH，一方面這可能與貴州自1999年引進鱘魚親本已有20年的培育，長期的地理隔離或者培育方式造成精子抗凍劑的不同；另一方面魚類精子超低溫冷凍保存研究與精子的稀釋液、解凍后激活液的成分等因素有關，下一步將對西伯利亞鱘精子超低溫精子保存的條件進一步優化，并開展超低溫保存精子解凍后的受精率的研究。

4 結 論

濃度為10%、15%、20%MeOH作為抗凍劑，精子解凍激活后A級精子活力占比均為0，B級在2.27%～5.31%，C級在9.34%～13.91%,D級在80.78%～88.39%；濃度為10%、15%、20% DMSO作為抗凍劑，精子解凍激活后A級精子占比在0%～25.37%，B級在4.67%～19.46%，C級在24.91%～35.13%，D級在30.26%～60.20%，其中15%DMSO處理組中A級精子占比最高，為25.37%。不同抗凍劑處理中，鱘魚精子的運動參數DMSO顯著高于MeOH，10%DMSO處理組鱘魚精子的運動參數各指標均顯著低于15%DMSO處理和20%DMSO處理，15%DMSO處理和20%DMSO處理間差異不顯著。綜上，西伯利亞鱘的精子超低溫冷凍保存抗凍劑以15%DMSO的抗凍效果最好。