PCR熒光探針法、乳膠法及培養法檢測生殖道分泌物中沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體的優劣分析

廖春潔 葉美萍 顧 昕 石 梅 周平玉,*

1.安徽醫科大學上海皮膚病臨床學院（上海 200050）；2.上海市皮膚病醫院（上海 200050）

淋球菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）和解脲支原體（Ureaplasma urelyticum，UU）是世界范圍內引起性傳播感染的常見病原體[1-2]。沙眼衣原體、解脲支原體和淋球菌感染泌尿生殖系統時會導致多種癥狀，男性患者出現尿道炎、附睪炎、前列腺炎、不孕癥，女性患者表現為陰道炎、宮頸炎、輸卵管炎、子宮內膜炎、異位妊娠、不孕等，而且女性患者癥狀常隱匿，若不治療或治療不當可通過垂直傳播導致胎兒流產、早產、新生兒結膜炎、新生兒肺炎等后果，嚴重危害孕產婦及新生兒的健康[3-5]。臨床上能夠采用快速、敏感、特異性高的檢測技術對沙眼衣原體、解脲支原體和淋球菌感染進行診斷十分重要。

性病病原體常見的檢測方法有病原體培養、特異性抗原抗體檢測、涂片鏡檢、血清學試驗及分子檢測等，各種方法各有其利弊，某些檢測方法存在結果判讀主觀性強（解脲支原體培養），靈敏度低（乳膠法檢測沙眼衣原體），一些病原體（如沙眼衣原體）存在培養困難、培養操作復雜、臨床不易實現等問題[6]，影響臨床的及時診斷和治療。熒光定量PCR技術是近30年來具有革命性的檢測技術，有研究顯示該方法對生殖道分泌物樣本檢測具有高靈敏度，并且檢測周期短、特異性強、可以進行定量分析，但無法判斷病原菌的耐藥是其缺陷[7-8]。為了探究不同檢測方法對沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體檢測的優劣性，本研究采用PCR熒光探針法對本院2018年8月-2020年8月性病門診采集的生殖道分泌物中的沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體進行檢測，并與相應的乳膠法及培養法的結果進行比較，探究不同檢測方法對分泌物中沙眼衣原體、淋球菌及解脲支原體的檢出率差異，并分析其對于臨床的意義。

材料和方法

一、研究對象

選取2018年8月到2020年8月就診于上海市皮膚病醫院性病科門診疑似泌尿生殖道感染的患者。

二、泌尿生殖道分泌物樣本采集

（一）男性樣本采集：使用無菌拭子輕柔伸入尿道2~3 cm處輕輕轉動拭子取出分泌物；（二）女性樣本采集：使用無菌拭子插入宮頸口1~2 cm內旋轉數次并停留數秒后取出。將取樣后的拭子按檢測要求浸入無菌生理鹽水和置入培養基中保存。（所有患者均在抗生素治療前進行采樣）

三、主要試劑及儀器

沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體的PCR熒光探針試劑盒購自上海科華生物工程有限公司；解脲支原體檢測（培養法）試劑盒購自珠海迪爾生物工程有限公司；衣原體抗原檢測（乳膠法）試劑盒購自杭州艾博生物醫藥有限公司；Thayer-Martin選擇性瓊脂基礎（MTM瓊脂基礎）培養基購自上海伊華醫學科技有限公司。PCR儀器：ABI7500實時熒光PCR儀器。

四、樣本的檢測

（一）PCR熒光探針法

嚴格按照PCR熒光探針試劑盒說明書進行操作，先通過熱裂解法提取分泌物樣本中病原微生物的DNA，以其作為模板，進行產物擴增。PCR反應條件為：50℃UNG酶處理2 min，93℃預變性2 min；93℃變性10 s，60℃退火、延伸及檢測熒光30 s，共40個循環。反應完成后，讀取實驗結果，陽性結果為樣本循環域值(cycle threshold，Ct)≤37，而Ct無數值或>40為陰性結果，若樣本閾值37

（二）沙眼衣原體抗原檢測法（乳膠法）

沙眼衣原體采用抗原檢測法（乳膠法）試劑盒進行檢測。按照說明書進行操作，在分泌物樣本中加入標本處理液A 8滴，混勻后再滴加標本處理液B 8滴，待混勻樣本充分裂解后滴入反應板加樣孔內，10~20min后觀察結果。陽性結果為質控區和反應區均出現紅色條帶；僅在質控區出現紅色條帶則為陰性結果。

（三）淋球菌檢測（培養法）

將采集的分泌物標本立即分區接種至MTM瓊脂基礎培養基中，將平皿置于35℃，5%CO2的培養箱中培養48~72小時，觀察細菌的生長。挑取圓形、稍凸、濕潤光滑、直徑為0.5~1mm、半透明或灰白色菌落，分別進行涂片革蘭氏染色和氧化酶試驗。陽性結果為：革蘭氏染色后鏡下可見革蘭氏染色陰性腎形雙球菌以及氧化酶試驗為陽性。

（四）解脲支原體檢測（培養法）

解脲支原體檢測（培養法）試劑盒進行檢測。試劑盒使用液體培養基培養法，接種生殖器分泌物樣本后，置37℃培養24~48 h。當酚紅指示劑由黃轉紅，表示有解脲支原體生長，判為陽性；若指示劑仍為黃色則判為陰性。

五、統計學分析

應用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，每種病原菌不同檢測方法檢出率的比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、PCR熒光探針法與乳膠法檢測生殖道分泌物中沙眼衣原體的結果比較

共采集587例患者的生殖道分泌物同時用于沙眼衣原體的PCR熒光探針法和乳膠法檢測，其中男性289名，女性298名。患者平均年齡為36.4±10.7歲。PCR熒光探針法對沙眼衣原體的陽性檢出率為11.9%（70/587），顯著高于乳膠法2.9%(17/587)，差異具有統計學意義（P<0.001）。對性別和不同年齡組的檢出結果進行分析，結果顯示男性和女性中PCR熒光探針法對沙眼衣原體的陽性檢出率均明顯高于乳膠法，差異均有統計學意義（P<0.001）；各年齡組PCR熒光探針法的檢出率也均高于乳膠法，除>40歲年齡組差異無統計學意義（P>0.05）外，其他年齡組差異均有統計學意義（P<0.001）。其中＜20歲組樣本較少，因此未進行統計學分析。見表1。

表1 PCR熒光探針法與乳膠法檢測沙眼衣原體結果的比較

二、PCR熒光探針法與培養法檢測生殖道分泌物中淋球菌的結果比較

共采集609例患者的生殖道分泌物用于淋球菌的PCR熒光探針法和培養法檢測，其中男性308名，女性301名。609例患者的平均年齡為36.4±10.8歲，范圍16~74歲。PCR熒光探針法對淋球菌的陽性檢出率9.0%(55/609)略高于培養法7.4%(45/609)，差異無統計學意義（P>0.05)。同時在性別及各年齡段分組中PCR熒光探針法的檢出率都略高于培養法，差異并無統計學意義（P>0.05)。其中<20歲組樣本較少，未進行統計學分析。見表2。

表2 PCR熒光探針法與培養法檢測淋球菌結果的比較

三、PCR熒光探針法與培養法檢測生殖道分泌物中解脲支原體的結果比較

共采集1022例患者的生殖道分泌物用于解脲支原體的PCR熒光探針法和培養法檢測，其中男性503名，女性519名。1022例患者的平均年齡為36.4±10.8歲，范圍14~75歲。PCR熒光探針法對解脲支原體的陽性檢出率為44.9%（459/1022）高于培養法40.0%（409/1022）,差異具有統計學意義（P<0.05）。不同性別及各年齡段分組中PCR熒光探針法的檢出率都略高于培養法，但差異只在男性組中具有統計學意義（P<0.05），在其他組中差異并無統計學意義（P>0.05）。其中＜20歲組樣本較少，因此未進行統計學分析，見表3。

表3 PCR熒光探針法與培養法檢測解脲支原體結果的比較

討 論

淋球菌、沙眼衣原體和解脲支原體是引起泌尿生殖道感染的主要病原體，其感染生殖道后可引起多種生殖道癥狀，在男性患者中可引起尿道炎和附睪炎，女性患者可出現盆腔炎和宮頸炎等，但大部分女性患者感染后，其臨床過程常隱匿、癥狀輕微，不易引起重視，耽誤治療，致使病情遷延，可能會發展為不孕癥、異位妊娠和慢性盆腔疼痛等嚴重后果[9-11]。因此，臨床上采用適合的檢測方法對性病病原體進行準確診斷并指導臨床合理用藥，對阻止病情遷延十分重要。

臨床上對于沙眼衣原體的檢測主要包括乳膠法和PCR熒光探針法，乳膠法檢測沙眼衣原體操作簡單、快捷，但敏感性不足，實驗室前期的研究結果顯示PCR探針法對沙眼衣原體的陽性檢出率明顯高于乳膠法（9.95%vs4.21%）[12]，我們的研究結果也顯示,PCR熒光探針法對于沙眼衣原體的檢出率顯著高于乳膠法（11.9%vs2,9%），PCR探針法可以很大程度上提高沙眼衣原體的陽性檢出率，避免患者漏診，所以在臨床上建議采用PCR熒光探針法對沙眼衣原體進行檢測；淋球菌和解脲支原體的檢測主要采用培養法和PCR熒光探針法，培養法是病原體檢測的“金標準”，培養法檢測淋球菌及解脲支原體具有高度的特異性，同時可以進行病原菌耐藥性分析，但培養法也存在培養時間長，培養結果受到標本采集、運送、保存等因素的影響，出現假陰性[13]，有研究顯示PCR熒光探針法對淋球菌的陽性檢出率高于培養法（6.64%vs4.16%），對解脲支原體的檢出率與培養法相近(37.6%vs36.8%)[14]，本研究結果顯示PCR熒光探針法對淋球菌的陽性檢出率略高于培養法(9.0%vs7.4%)，差異并無統計學意義，但我們的結果出現10例PCR熒光探針法結果陽性而培養法陰性的病人，PCR探針法在檢測隱匿感染和癥狀不明顯的淋病患者時優于培養法[12]；PCR熒光探針法對解脲支原體的陽性檢出率高于培養法（44.9%vs40.0%），有研究顯示解脲支原體可以引起女性不孕[15],但也有研究顯示解脲支原體可能是條件致病菌，因此盡管解脲支原體培養法有結果判讀主觀性強的缺點，但依據核酸陽性（PCR探針法檢測）來治療解脲支原體感染可能存在過度治療和抗菌素濫用[16]。目前臨床已經廣泛應用PCR熒光探針法檢測沙眼衣原體、解脲支原體和淋球菌，PCR熒光探針法檢測病原體具有特異性高、敏感性強、檢測周期短和污染概率小等優勢[17-18]，但該方法無法對病原菌進行藥物敏感性分析，不能指導臨床合理用藥，無法完全替代傳統的培養法。隨著抗生素的廣泛應用，淋球菌對于抗菌藥物的耐藥現象越來越嚴重，多重耐藥菌的出現已經引起公共衛生的重視[19]，解脲支原體耐藥也同樣受到臨床關注[20],故采用能夠進行耐藥分析的培養法對淋球菌和解脲支原體進行檢測對臨床選擇正確的治療方法具有十分重要的意義。

值得注意的是，我們對不同年齡段性病病原體感染情況進行分析，不考慮性別因素，結果顯示患者主要集中在20~40歲年齡段，該年齡層的人群正處于性活躍期，不及時治療會增加性病傳播的風險，同時該年齡的人群正處于生育階段，沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體的感染都可能會導致患者不孕不育及增加不良妊娠的風險，所以能夠早期準確診斷、及時有效治療、避免并發癥尤為重要。PCR探針法檢測生殖道分泌物中的沙眼衣原體、淋球菌和解脲支原體時，不僅可以提高病原菌的陽性檢出率，同時可以做到一支采樣拭子同時檢測多種病原體，減少了男性患者多次采樣的痛苦,對隱匿感染的女性也具有重要的篩查意義，是一種值得推薦的性病病原體檢測方法，對于考慮淋球菌或解脲支原體感染的患者時，需增加培養法同時檢測，根據藥敏實驗結果，指導臨床準確用藥，提高治療效果，避免不孕不育、不良妊娠等嚴重結局的發生。