紫蘇腺毛的形態及發育研究△

李衛萍，姚宇，溫春梅，郭佳琪，郭寶林

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

紫蘇葉來源于唇形科植物紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.的葉，揮發油是其發揮功效的主要成分[1]。目前，多采用提取獲得的揮發油研究紫蘇葉揮發油含量及組分受采收時間、采收部位、栽培條件等因素影響的情況[1-3]，而從紫蘇產生揮發油的器官開展研究將獲得更為直接的信息。已有研究報道，唇形科植物的揮發油由植物地上部分表皮腺毛合成和分泌[4-5]，紫蘇葉中腺毛分為頭狀腺毛和盾狀腺毛[6-8]。本研究對紫蘇葉表皮腺毛類型、分布、產生和貯藏揮發油的功能進行研究，以期建立腺毛種類、數量、分泌揮發油的情況與紫蘇揮發油含量的關系，從而進行紫蘇種質揮發油評價，為紫蘇良種選育提供參考。

1 材料

1.1 樣品

3份紫蘇分別來源于日本(RB-1)、中國河北(AGZ-12)和浙江(ZhJ-2Y2Z)，經中國醫學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定為紫蘇Perillafrutescens(L.)Britt.。將3份紫蘇種植于北京市海淀區中國醫學科學院藥用植物研究所南園實驗田。采集5個不同發育階段的葉片，分別為未展開葉(位于莖尖)、幼葉Ⅰ(第一莖節上幼葉，葉面積約為成熟葉的1/20)；幼葉Ⅱ(第二、三節莖節上幼葉，葉面積約為成熟葉的1/4)；成熟葉Ⅰ(第四莖節成熟葉剛完全展開)；成熟葉Ⅱ(第十莖節上成熟葉，已開始衰老)[9]。

1.2 儀器

DM2599型光學顯微鏡(德國Leica 公司)。

1.3 試藥

熱離析液(30% H2O2-冰醋酸=1∶1)；醋酸甘油(50%冰醋酸-甘油-蒸餾水=1∶1∶1)；1，4-對亞硝基苯酚(色譜純，東京化成工業株式會社)；2，4-二硝基苯肼(色譜純，上海麥克林生化技術有限公司)。

2 方法

2.1 透明葉觀察法

選取主脈部分的葉尖、葉基和葉中部，葉表皮部分中部的葉緣及主脈和葉緣之間的葉中(部分樣品于多個部位的葉片和葉緣上取樣，范圍為葉尖部到葉基部)共5個部位，徒手切片法取5 mm×5 mm的小塊，加60 ℃離析液保持40 min使葉片透明，加醋酸甘油1～2滴封片，采用光學顯微鏡觀察葉正面和背面腺毛形態特征并拍照[9]。

2.2 組織化學觀察法

取葉中約5 mm×5 mm的小塊，分別用1，4-對亞硝基苯酚(單萜類成分染色劑)、2，4-二硝基苯肼(萜類成分染色劑)染色后用光學顯微鏡觀察拍照[10-11]。

3 結果

3.1 腺毛類型及分布

3.1.1類型 通過觀察成熟葉Ⅰ的腺毛發現，紫蘇的腺毛分為盾狀腺毛和頭狀腺毛2類。其中，盾狀腺毛又名腺鱗，由單細胞或多細胞構成，含有多個分泌細胞并呈輻射狀排列[12]。這2類腺毛都由基細胞、莖細胞和頭部細胞3部分組成。盾狀腺毛的組成為基細胞1、短小的莖細胞1、頭部細胞8。成熟的盾狀腺毛中，頭部細胞通常可見大量揮發油狀分泌物(圖1)。頭狀腺毛有長柄頭狀腺毛和短柄頭狀腺毛2種。長柄頭狀腺毛包括1枚基細胞、2枚伸長的莖細胞及1或2枚頭部細胞(圖2～3)。短柄頭狀腺毛包括1枚基細胞、1枚較短的莖細胞及1、2或4枚頭部細胞(圖4～7)。

注：PGT表示盾狀腺毛細胞；下圖同。圖1 位于紫蘇葉背面的頭部8個細胞的盾狀腺毛

注：CGT表示頭狀腺毛細胞；下圖同。圖2 位于紫蘇葉背面葉脈的頭部有1個細胞的頭狀腺毛

圖3 位于紫蘇葉背面葉脈的頭部有2個細胞的頭狀腺毛

圖4 位于紫蘇葉正面的頭部有2個細胞的頭狀腺毛

圖5 位于紫蘇葉正面葉脈的頭部有1個細胞的頭狀腺毛

圖6 位于紫蘇葉正面葉脈的頭部有2個細胞的頭狀腺毛

3.1.2分布 紫蘇的葉片兩面均生有腺毛，葉正面僅有短柄頭狀腺毛，分布于葉脈和非葉脈部分的葉表皮，頭部以2細胞為主，少有1細胞，稀有4細胞見于葉脈上。葉背面兼有盾狀腺毛和2種頭狀腺毛，盾狀腺毛數量大，分布于葉脈和葉表皮上，短柄頭狀腺毛也以頭部2細胞為主，1細胞少見，分布于葉脈和葉表皮上，長柄頭狀腺毛稀見于葉脈(表1)。

表1 紫蘇葉腺毛分布情況

3.2 組織化學鑒定

對紫蘇成熟葉片進行組織化學鑒定，結果表明，2種頭狀腺毛均未產生顏色變化(圖8～9)，表明頭狀腺毛中萜類成分較少。而紫蘇葉片上成熟的盾狀腺毛經4-亞硝基苯酚染色后呈深棕褐色(圖8)，經2，4-二硝基苯肼染色后呈深紅褐色(圖9)，說明單萜類成分主要存在于紫蘇葉片的成熟盾狀腺毛中。

圖8 4-亞硝基苯酚染色紫蘇葉片腺毛

圖9 2，4-二硝基苯肼染色紫蘇葉片腺毛

3.3 盾狀腺毛的發育過程

3.3.1不同生長階段的葉片 幼葉Ⅰ正面和背面均被大量非腺毛覆蓋(圖10～11)，背面多數盾狀腺毛頭部為8細胞，尚有部分頭部細胞為2～6個不等，或不可見清晰的頭部細胞。幼葉Ⅱ盾狀腺毛基本發育完全，具有8細胞的頭部(圖12～13)，僅葉基上的部分盾狀腺毛是未完全發育的狀態。

注：NG表示非腺毛；下圖同。圖10 幼葉Ⅰ葉尖背面的腺毛

圖11 幼葉Ⅰ葉尖正面的腺毛

圖12 幼葉Ⅱ葉基背面盾狀腺毛

圖13 幼葉Ⅱ葉尖背面盾狀腺毛

成熟葉全部為8細胞頭部的盾狀腺毛，但腺毛密度有所降低(圖14～16)。

圖14 成熟葉Ⅰ葉尖背面腺毛

圖15 成熟葉Ⅱ葉尖背面葉脈上盾狀腺毛

圖16 成熟葉Ⅰ葉基背面盾狀腺毛

綜上所述，盾狀腺毛在幼葉處發育程度，隨著葉片成熟至老化，其密度降低。無論是幼葉還是成熟葉中，均可觀察到盾狀腺毛產生一定量的分泌物。

3.3.2同一葉片的不同部位 幼葉至成熟葉葉脈上的盾狀腺毛充滿分泌物，分泌物由尖部至基部逐漸出現。葉脈同一位點上的盾狀腺毛有2種狀態并存現象，即充滿分泌物及未見大量分泌物狀態(圖17～18)。無論幼葉還是完全成熟的葉片均有此現象(圖15)。

圖17 幼葉Ⅰ葉尖背面葉脈上盾狀腺毛

圖18 幼葉Ⅰ葉尖背面葉脈上盾狀腺毛

幼葉期，葉表皮上由尖部至基部發育程度逐漸降低，而腺毛密度變大。同一位點上，盾狀腺毛的分泌程度差異較小(圖12～13)；成熟期葉表皮腺毛的變化情況類似，由尖部至基部密度變大，均為具有較多分泌物的成熟盾狀腺毛(圖14、16)。

與位于葉脈上的盾狀腺毛相比，位于葉表皮上的盾狀腺毛更早開始充斥分泌物。隨著葉片逐漸成熟，葉脈的同一位點可持續發育出新成熟的盾狀腺毛并行使分泌功能。整體而言，葉表皮上的盾狀腺毛密度更大。

4 討論

唇形科不同屬種之間腺毛類型、分布和密度有所不同，可作為屬種間的一種分類特征，不同種類中擁有腺毛的類型為1種或2種[13-14]。本研究中3份紫蘇種質的表現具有較好的一致性，葉片上的腺毛類型有頭狀腺毛和盾狀腺毛2種，與唇形科鼠尾草屬和假荊芥屬植物類似。其中，頭狀腺毛又分為短柄腺毛和長柄腺毛2種[15-17]。前期研究表明，紫蘇盾狀腺毛數量較多且分布在葉片背面，由1個基部細胞、1個莖部細胞及1個包括8個分泌細胞的膨大頭部組成；紫蘇的頭狀腺毛由1個基部細胞、1個莖部細胞和1個包括1、2、4個分泌細胞的頭部組成[6-8]。本研究結果與此前報道一致，但未發現頭部有16個細胞組成的盾狀腺毛[8]。本研究進一步發現，盾狀腺毛不僅分布在非葉脈的葉表皮上，還有較多出現葉脈上；頭部為1、2個細胞的短柄頭狀腺毛廣泛分布于葉正面和背面的葉表皮和葉脈上，且葉脈上較多。首次發現2種稀有頭狀腺毛，一種是頭部為4個細胞的短柄頭狀腺毛，另一種是由1個基細胞、2個伸長的莖細胞及1、2個頭部細胞組成的長柄頭狀腺毛。這2種腺毛僅分布于葉背面葉脈上且較為少見。

本研究中，3份紫蘇種質的盾狀腺毛密度及發育無明顯差異。紫蘇幼葉的盾狀腺毛已經有較大的密度和分泌程度，至成熟葉時盾狀腺毛的密度開始下降。與先前報道發現的紫蘇腺毛在幼葉形成時已完成發育、成熟葉上無新腺毛產生基本一致[6]。紫蘇葉表皮上分布的盾狀腺毛密度較大，在相同位點上葉表皮的盾狀腺毛發育情況基本相同，而葉脈上分布的盾狀腺毛密度較低，且同一位點上可觀察到腺毛發育程度不同，其分泌物含量也有較大差異。無論是葉表面還是葉脈，由尖部至基部的盾狀腺毛的發育程度降低且密度變大。綜上所述，研究整張葉片的腺毛分布可以選擇即將完全成熟葉，尤其是葉片表面的中部。對該部位的盾狀腺毛的研究，在應用方面更具有現實意義，也與揮發油產量有較高的相關性[9]。

植物次生代謝產物定位常用組織化學染色實現[18-19]。前期關于植物組織化學研究發現，紫蘇葉片表皮萜類物質主要存在于盾狀腺毛的分泌物中[9]，與報道中鼠尾草屬和假荊芥屬唇形科植物一致[15，17]。研究表明，薄荷中萜類物質的最大合成率取決于處在分泌時期的腺毛數量，而盾狀腺毛是分泌精油的主要腺體。因此，盾狀腺毛數量越多，分泌越旺盛，揮發油合成率越高[20]。薄荷品質評價的研究明確了盾狀腺毛數量與揮發油產量存在顯著正相關關系，可用于質量評價[21]。紫蘇的盾狀腺毛與揮發油產量似乎也有類似的關系。本課題組前期研究認為，紫蘇葉片揮發油隨葉片成熟迅速合成積累，葉片不同成熟度的揮發油得率為成熟葉(0.93%)>嫩葉(0.50%)>老熟葉(0.36%)[2]。本研究中觀察到，幼嫩葉上盾狀腺毛密度>老熟葉片盾狀腺毛密度。因此，推斷紫蘇盾狀腺毛密度與揮發油產量具有一定正相關，值得進一步研究探討。