基于特征肽段的鹿茸及其混偽品種的專屬性鑒別研究△

郭曉晗，程顯隆，柳溫曦，李明華，魏鋒，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版一部規定鹿茸為鹿科動物梅花鹿CervusnipponTemminck或馬鹿C.elaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，前者稱為花鹿茸，后者稱為馬鹿茸。此外，白唇鹿C.albirostrisPrzewalski和水鹿C.unicolorKerr茸在四川、甘肅地方標準中也可作為鹿茸藥用。據市場調研，目前市場上常以馴鹿RangifertarandusLinnaeus茸作為鹿茸銷售，偽品、劣品和混淆品的出現導致了鹿茸市場的混亂。作為傳統名貴中藥材，鹿茸質量控制方法雖多，但并不完善，面對鹿茸摻偽造假及市場的混亂問題，建立一套準確性好、靈敏度高、專屬性強的鹿茸真偽鑒別體系尤為重要。

近年來研究表明，鹿茸中蛋白質的含量隨生長周期呈較為規律的變化，即蛋白質含量從鹿茸頂部到基部逐漸減少[2]，其含量及種類影響著鹿茸品質的高低，有望成為鹿茸質量評價體系中重要的指標成分。目前以蛋白質或氨基酸為分析對象的動物藥檢測方法主要有薄層色譜法、凱氏定氮法和分光光度法等。基于膠原蛋白的同源性，不同動物的膠原蛋白具有相似的化學性質[3-4]，因此這些方法難以區分主要含有膠原蛋白大分子的鹿茸及其混偽品。基于生物遺傳學特點，雖然同科不同屬的鹿茸蛋白序列接近，但必然也存在氨基酸序列上的差異。液相色譜-質譜法(LC-MS)可以針對蛋白質序列進行差異性分析，隨著LC-MS在中藥檢驗中的應用，測定動物藥中蛋白質成分的方法逐漸成熟[5-14]。因此，本研究采用蛋白質酶切、LC-MS肽段檢測及數學統計等方法，找出不同品種鹿茸的特征肽段，建立可用于鹿茸及其混偽品的專屬性鑒別方法，為鹿茸及相關制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 試藥

花鹿茸40批(編號為HLR-1～HLR-40)、馬鹿茸10批(編號為MLR-1～MLR-10)收集于吉林東豐藥業有限公司鹿茸養殖基地，馴鹿茸10批(XLR-1～XLR-10)收集于吉林西豐藥材市場。60批樣品均由遼寧省食品藥品檢驗研究院中藥室王維寧主任藥師鑒定，分別為梅花鹿CervusnipponTemminck、馬鹿C.elaphusLinnaeus或馴鹿RangifertarandusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

胰蛋白酶、亮氨酸腦啡肽、甲酸(Sigma-Aldrich公司)；乙腈(Thermo Fisher Scientic公司)；碳酸氫銨(國藥集團化學試劑有限公司)；水為Milli-Q純水。

1.2 儀器

Synapt G2-S型Q-TOF MS液相色譜質譜聯用儀，XevoTM TQ-S MS型液相色譜質譜聯用儀(美國Waters公司)；FED-115型熱循環干燥箱(德國Binder公司)；DH-101-2BS型恒溫恒濕培養箱(天津市中環實驗電爐有限公司)。

2 方法與結果

2.1 馴鹿茸專屬性特征肽段的研究

2.1.1色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITYTM UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫為40 ℃；進樣量為5 μL；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～25 min，95%～80%A；25～40 min，80%～50%A)；流速為0.3 mL·min-1。

2.1.2質譜條件 選用電噴霧離子源，正離子模式；離子源溫度為120 ℃；毛細管電壓為3 kV，錐孔電壓為20 V；去溶劑溫度為450 ℃，去溶劑氣體流速為600 L·h-1；全信息串聯質譜(MSE)連續方式采集數據，掃描質量數m/z50～1200，掃描時間為0.2 s；低碰撞能量為8 V，梯度碰撞能量為10～40 V；碰撞氣體為高純氬氣。

2.1.3溶液制備 胰蛋白酶溶液：取適量胰蛋白酶，加1%碳酸氫銨溶液溶解，制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液。

空白溶液：取1%碳酸氫銨溶液，濾過，取續濾液100 μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液20 μL，充分混勻，于恒溫恒濕箱中酶解12 h，即得。

供試品溶液：取供試品粉末約0.3 g于安瓿瓶中，加水10 mL，熔封，于烘箱中120 ℃加熱12 h，取出，趁熱濾過，蒸干，用1%碳酸氫銨溶液溶解并定容至10 mL，用微孔濾膜濾過，取續濾液100 μL，置微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液20 μL，充分混勻，于恒溫恒濕箱中酶解12 h，即得。

2.1.4數據采集 利用UPLC-Q-TOF MS系統，在2.1.1～2.1.2項下色譜和質譜條件下，分別對空白和供試品溶液進行數據采集，得到3種鹿茸樣品的總離子流圖，見圖1。以馴鹿茸樣品(XLR-1)為例，選擇提取在整個數據采集過程中保留時間均勻分布的8個共有色譜峰進行方法學考察，分別為m/z739.839 6、m/z583.813 5、m/z790.885 7、m/z575.820 3、m/z793.885 0、m/z780.907 8、m/z931.788 9、m/z711.374 6。相應的提取離子色譜圖見圖2。

注：A.花鹿茸(HLR-1)；B.馬鹿茸(MLR-1)；C.馴鹿茸(XLR-1)。圖1 花鹿茸、馬鹿茸、馴鹿茸酶解肽的總離子流圖

圖2 馴鹿茸樣品(XLR-1)8個色譜峰的提取離子流色譜圖

2.1.5精密度試驗 取供試品溶液，按照2.1.1～2.1.2項下色譜和質譜條件，重復進樣6次，選取上述8個單一色譜峰進行提取，測得8個色譜峰保留時間和精確質量數的RSD均小于1%。

2.1.6重復性試驗 取同一份樣品6次，每次約0.3 g，精密稱定，制備供試品溶液6份，按照2.1.1～2.1.2項下色譜和質譜條件分別進樣，選取上述8個單一色譜峰進行提取，測得8個色譜峰保留時間和精確質量數的RSD均小于1%，結果表明，重復性較好。

2.1.7穩定性試驗 取供試品溶液，按照2.1.1～2.1.2項下色譜和質譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h測定。選取上述8個單一色譜峰進行提取，測得8個色譜峰的保留時間和精確質量數基本保持一致，RSD均小于1%，說明樣品在10 h內穩定。

2.1.8數據分析 利用Waters統計分析軟件，設定保留時間為1～40 min，質譜允許偏差為0.05 amu，保留時間偏差設為0.2 min，設定適宜的噪音消除水平和強度閾值。先將60批樣品的液質圖譜數據降維，轉換成數據對(精確質量-保留時間，EMRT)；并進行主成分分析，結果見圖3。結果顯示，馴鹿茸可與花鹿茸、馬鹿茸進行良好的區分。將花鹿茸和馬鹿茸合并為一組，結合正交偏最小二乘法-判別分析對數據進行整合分析，得到馴鹿茸與正品鹿茸的數據分析結果散點圖，見圖4。在輪廓呈S形的散點圖(S-plot)中，曲線兩端的EMRT數據對代表了來自2個樣品組的可信度高的特征離子。

注：HLR.花鹿茸；MLR.馬鹿茸；XLR.馴鹿茸。圖3 馴鹿茸與花鹿茸、馬鹿茸的主成分分析

圖4 馴鹿茸與花鹿茸、馬鹿茸比較的S-plot散點圖

經過數據分析軟件對質譜數據的分析、挖掘與篩選，并在總離子流圖中初步驗證的情況下，最終尋找到2個馴鹿茸專屬性較好的離子，分別為m/z575.820 3(9.48 min，雙電荷)、m/z583.813 5(8.05 min，雙電荷)。這2個特征離子在馴鹿茸與花鹿茸、馬鹿茸中的相對離子強度分布見圖5。為確認這2個離子的靈敏度及準確性，利用超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-QQQ/MS)，分別選擇m/z575.8和m/z583.8為母離子，優化其傳輸電壓和碰撞能量，結合選擇離子模式和子離子模式，分別確定了2個子離子，從而形成4組離子對，分別是8.38 min：m/z583.8→m/z455.9、m/z583.8→m/z910.7；9.80 min：m/z575.8→m/z447.9、m/z575.8→m/z894.8。

注：A.m/z 575.820 3；B.m/z 583.813 5。圖5 2個特征離子m/z 575.820 3、m/z 583.813 5在3種鹿茸樣品中的相對強度分布

2.1.9馴鹿茸專屬性特征肽段的驗證 在優化好的傳輸電壓和碰撞能量下，基原準確的花鹿茸、馬鹿茸、馴鹿茸樣品溶液及空白溶液在多反應監測(MRM)模式下測試，結果顯示，這4組特征離子對均只在馴鹿茸樣品中檢測到，說明這4組特征離子對具有專屬性，可用于正品鹿茸(梅花鹿、馬鹿)樣品中混有偽品鹿茸(馴鹿)的專屬性鑒別。

2.2 鹿茸特征圖譜的研究

根據對正品鹿茸的酶解肽段的數據分析，以總離子流色譜圖中兩者共有、保留時間合適、響應高為原則，經過比較，確定4個離子為候選母離子，見表1。結合UPLC-QQQ/MS，采用ESI+模式，在適宜的質譜參數條件下，優化4個離子的傳輸電壓和碰撞能量，分別篩選響應較高的2個離子為子離子，形成8組特征離子對，相應信息見表1。從而在MRM下，對40批花鹿茸、10批馬鹿茸進行測定，以特征肽段為分析指標，建立了鹿茸藥材的特征圖譜，見圖6。

表1 鹿茸特征肽段離子的相關信息

注：A.花鹿茸；B.馬鹿茸；1.m/z 730.5(雙電荷)→594.1，1 090.4；2.m/z 634.4(雙電荷)→549.2，731.2；3.m/z 793.9(雙電荷)→733.3，1 215.4；4.m/z 780.9(雙電荷)→608.7，991.5。圖6 鹿茸的特征圖譜

3 總結與討論

動物藥材是中藥的重要組成部分，被認為具有活性強、潛力大和應用廣等優勢。但是，與植物類中藥相比，動物藥材在鑒別和質量評價方面的研究發展緩慢、體系薄弱，特別是缺乏專屬的鑒定指標與質量評價手段。

目前鹿茸的質量標準相對簡單，只有鑒別項，且檢測指標氨基酸成分缺乏專屬性，無法對摻假的鹿茸品種進行鑒別；另外，多種成藥使用鹿茸為原料，如“人參鹿茸丸”“鹿茸口服液”“鹿茸精注射液”等，由于質量標準中無專屬性控制項目，導致含鹿茸原料的成藥質量更加難以控制。

本研究將蛋白質酶切技術、液質聯用技術及生物信息統計模型結合統計學分析方法應用于鹿茸特征多肽的分析，成功找到偽品鹿茸(馴鹿)的2個特征肽段，可用于正品鹿茸(梅花鹿、馬鹿)中混有偽品鹿茸(馴鹿)樣品的智能鑒別，該方法專屬性好，很大程度上改善了目前鹿茸的質量評價方法。此法不僅可用于鹿茸藥材的真偽鑒別，對于含鹿茸的成藥或者動物藥材的質量評價方法的開發也具有借鑒意義。梅花鹿與馬鹿同為鹿科鹿屬，兩者物種親緣關系較近，均為《中國藥典》2020年版規定的“鹿茸”的基原。主成分分析結果表明，花鹿茸與馬鹿茸不能進行有效區分。本研究雖未找到花鹿茸和馬鹿茸的專屬性特征肽段，但是基于特征肽段建立的特征圖譜也具有一定的專屬性，可用于鹿茸的定性鑒別，此外，特征肽段氨基酸序列的解析和確證是后期建立可用于定量測定的LC-MS/MS的基礎，從而將偽品鹿茸的專屬性特征肽段、鹿茸的特征圖譜、以特征肽段為含量測定指標的LC-MS/MS統一形成鹿茸特征肽智能識別信息庫，為鹿茸藥材及相關制劑的質量控制和評價提供參考。