開心散含藥血清對Aβ1-42損傷的神經干細胞增殖和分化能力的影響

鄧艷，時悅，肖洪賀，李妍，陳吉聰，李婉嫕，楊靜嫻

遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

阿爾茨海默病(AD)是一種神經退行性疾病，以β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的炎性老年斑(SP)和tau蛋白異常磷酸化形成的神經纖維纏結(NFTs)及腦內神經元丟失為主要病理特征。AD發病機制復雜，目前尚未完全闡明，主要有Aβ沉積、tau過度磷酸化、膽堿能突觸功能損傷、氧化應激、炎癥損傷和鈣離子穩態失衡、神經元死亡等學說[1]。其中，以Aβ沉積學說最為公認。Aβ最主要的組成為Aβ1-40和Aβ1-42，而Aβ1-42更容易聚集成寡聚體，對神經細胞的毒性較強，能夠直接導致神經元死亡[2]。AD病因的復雜性和多因素性為其治療提出了挑戰。目前，西醫尚無法完全治愈AD，只能以緩解癥狀為主。因此，最緊要的問題是尋找從根本上治療AD的新方法[3]。中醫中藥的應用從整體觀念出發，將研究思路從單體成分及單個靶點治療調整為整體探究、系統調節的方式[4]，通過多靶點間的相互作用實現增效減毒的效果[5]，這與AD發病的復雜病理生理機制相符合。

近年來，神經干細胞(NSCs)技術在多種疾病中得到應用，在AD的治療中也有廣闊的應用前景[6]。NSCs是一種具有自我更新能力的多潛能細胞，能夠分化出各種類型的神經細胞，參與到神經再生過程中。神經再生過程主要包括4個階段，即：1)NSCs存活、增殖和分化；2)新生神經元的成熟；3)突觸形成；4)神經回路整合。AD患者隨著年齡增長，腦中的神經再生能力逐漸下降，同時Aβ能顯著抑制NSCs的增殖和遷移能力[7-8]，所以在病理情況初期保護NSCs免受損傷、促進NSCs增殖及分化尤為重要。

開心散是治療健忘的經典名方，在2018年4月被國家中醫藥管理局會同國家藥品監督管理局制定的《古代經典名方目錄(第一批)》收錄。開心散由人參、遠志、石菖蒲和茯苓4味藥組成，具有益氣補虛、安神定驚、益智、交通心腎的作用?，F代藥理研究證實，干細胞與“腎精”具有同一性，被認為是腎精在細胞層面的體現[9-10]。開心散補腎益精的功效可激發臟腑潛在的機能，即激活并促進NSCs增殖與分化，起到修復再生AD受損組織、恢復功能的作用。開心散可促進小鼠長時程增強效應(LTP)形成，調節突觸后密度蛋白-95(PSD-95)的表達，增強突觸可塑性[11]；能夠調控炎癥因子Bcl-2及Bax的表達[12]；可以通過激活環磷酸腺苷(cAMP)依賴的信號通路，使神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)表達增加，進而上調突觸素的表達[13]；還作用于膽堿能系統，降低乙酰膽堿酯酶、活性氧、丙二醛的水平和活性[14]。利用Aβ造模的小鼠，在造模前7 d給予開心散后，能增加突觸前膜Synapsin 1磷酸化，改善Aβ誘發的小鼠記憶障礙[15]。所以，開心散治療神經退行性疾病具有廣闊的臨床應用前景。本研究采用Aβ1-42寡聚體孵育NSCs制備AD細胞模型，模擬AD患者腦內NSCs，探討開心散含藥血清對病理狀態下NSCs增殖和分化能力的影響，為開心散治療AD提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠購于遼寧長生生物有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK(遼)2017-0001。小鼠一雄一雌合籠，飼養于20～25 ℃環境，自由飲食和飲水，每日光照12 h。將孕鼠單獨一籠飼養直至生產，取48 h內新生乳鼠用于實驗。研究中所有實驗動物相關操作都經過遼寧中醫藥大學倫理審查委員會批準并嚴格按照國際實驗倫理行為準則實行，實驗動物使用許可證編號為SYXK(遼)2019-0004。

1.2 試藥

人參PanaxginsengC.A.Meyer(江西樟樹天齊堂中藥飲片公司)；遠志PolygalatenuifoliaWilld(安徽石田中藥飲片有限公司)；茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf(安國市安興中藥飲片有限公司)；石菖蒲AcortwtatarinowiiSchott(安國市輝發中藥飲片加工有限公司)均由遼寧中醫藥大學藥學院楊靜嫻教授鑒定為正品。DMEM、DMEM/F12培養基，胎牛血清(FBS)，25%胰蛋白酶，青-鏈雙抗(Gbico公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)；CyTM3標記羊抗鼠二抗(Jackson公司)；表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)購自PeproTech公司；硫酸軟骨素蛋白多糖2(NG2)抗體(Upstate公司)；膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、Ki67抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；中分子量神經絲蛋白(NF-M)抗體(StemCell公司)；巢蛋白(Nestin)抗體(Millipore公司)；Aβ1-42(南京肽業生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司)。

1.3 儀器

Ti-S型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器公司)；UV-5600型紫外-可見光分光光度計(上海元析公司)。

2 方法

2.1 開心散含藥血清的制備

《千金要方》中記載開心散組成為“遠志、人參各四分，茯苓二兩，菖蒲一兩”[16]。取人參、遠志、茯苓、石菖蒲飲片，粉碎，過60目篩，按1∶1∶50∶25(共200 g)制備開心散[17]，加入10倍量純凈水，浸泡過夜，回流提取2 h，濾過；再加入8倍量純凈水，繼續回流提取2 h，濾過；合并2次濾液，減壓濃縮至生藥質量濃度為4.8 g·mL-1，于-20 ℃凍存，備用。

依據體表面積換算法[18]，將成人每日所需生藥量換算成小鼠所需藥量。60 kg的成人每日需開心散114.88 g，換算成20 g小鼠每日所需生藥量為0.480 5 g，作為開心散中劑量組。將6月齡SPF級C57BL/6小鼠隨機分為4組，每組10只，分別灌胃給予0.9%氯化鈉溶液和開心散48、24、12 g·kg-1(以生藥量計)，每天1次，連續7 d[19]。末次給藥2 h后，小鼠眼眶采血，室溫靜置30 min，3000 r·min-1離心15 min(離心半徑為3.5 cm)，取上層血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，分裝，制得高、中、低劑量開心散含藥血清，置-20 ℃保存備用。

2.2 Aβ1-42寡聚體的制備

Aβ1-42粉末加入六氟異丙醇，溶解，揮干，加入含有1%二甲基亞砜(DMSO)的DMEM/F12，使其濃度為200 μmol·L-1，4 ℃下孵育24 h，制得終濃度為200 μmol·L-1的Aβ1-42寡聚體，24 h內使用[20]。

2.3 NSCs的體外培養與鑒定

取48 h內新生乳鼠海馬，剪碎，加入0.125%胰酶，消化15 min，反復吹打后，過70 μm篩網，得到含有NSCs的單細胞混懸液，離心后，加入增殖培養基復懸，以2×106個/mL密度接種于24孔板內，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，2～3 d半量換液，培養7～10 d傳代[21]。取第3代的NSCs以2×105個/mL的密度重新接種于96孔板內，采用免疫熒光法(IF)鑒定培養NSCs的Nestin表達情況。

2.4 CCK-8法檢測NSCs的存活

將機械性吹打后的NSCs以2×106個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μL，分為對照組、模型組及開心散含藥血清高(KXS-H)、中(KXS-M)、低(KXS-L)劑量組，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。對照組和模型組給予10%空白血清，各給藥組分別對應給予10%的開心散含藥血清[22]。給藥24 h后，加入Aβ1-42使其終濃度為20 μmol·L-1，孵育24 h，參照CCK-8試劑盒說明書，設立只含培養液的空白組，各組培養孔內加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h后，用酶標儀檢測450 nm處吸光度(A)值，根據公式(1)計算細胞存活率。

細胞存活率=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×
100%

(1)

2.5 NSCs增殖能力檢測

2.5.1NSCs直徑測量 細胞隨機分為對照組、模型組、KXS(給予10%開心散含藥血清中劑量)組，給藥及Aβ1-42孵育同2.4項下。孵育24 h后，將各組NSCs機械性吹打為單個細胞，并在增殖培養基內連續培養7 d，分別在第三、五、七天拍照記錄，采用Image J軟件進行神經球計數和直徑測量。每組進行6次平行實驗，每組取10個神經球測量直徑。

2.5.2IF檢測Ki67蛋白表達 細胞分組及處理同2.5.1項下，選用培養至第三天的神經干細胞，用IF法檢測Ki67蛋白表達情況。將培養于96孔板中的各組細胞用4%多聚甲醛常溫固定，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；1%Triton X-100透化10 min，PBS清洗3次；加5%BSA溶液封閉后PBS洗滌；每孔滴加用1%BSA稀釋的Ki67一抗(1∶150)4 ℃孵育過夜，次晨用PBS清洗；加入CyTM3標記的羊抗鼠二抗(1∶200)室溫避光孵育1 h，PBS緩沖液洗3次；DAPI染色液復染，PBS清洗，滴加少量防熒光淬滅劑，使用熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄，采用Image J對陽性細胞進行計數。

2.6 IF檢測NSCs的分化能力

取第3代NSCs，細胞分組及處理同2.5.1項下。細胞打散后接種于分化培養基(含有10% FBS和1% P/S的DMEM/F12)中誘導分化，培養14 d，用IF法檢測其分化情況。4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗，0.5%Triton X-100透化15 min，PBS清洗，5%FBS封閉30 min，分別加入用1%BSA稀釋的NF-M(1∶100)、GFAP(1∶100)、NG2(1∶100)和Nestin(1∶100)一抗，4 ℃過夜，PBS清洗，加入CyTM3標記的羊抗兔二抗(1∶200)，室溫孵育1.5 h，DAPI染液復染5 min，滴加少量防熒光淬滅劑，熒光倒置顯微鏡下(200×)觀察。每組進行6次平行實驗，每孔隨機取3個視野，進行采用Image J統計細胞數量。

2.7 統計學分析

3 結果

3.1 NSCs的體外培養與鑒定

原代培養的NSCs呈懸浮細胞球，折光性強，單個存在。經IF鑒定神經球表達Nestin蛋白，且陽性率達90%以上，證明其具有良好的NSCs特性(圖1)。

圖1 NSCs的培養與IF鑒定

3.2 開心散含藥血清對NSCs存活率的影響

CCK-8結果顯示，與對照組比較，模型組NSCs存活率顯著降低[(52.23±4.84)%，P<0.01]。KXS-H、KXS-M、KXS-L組細胞存活率分別為(85.2±9.61)%、(83.47±9.05)%、(80.17±4.09)%，與模型組比較，細胞存活率均顯著增高(P<0.01)。說明開心散含藥血清可以提高NSCs存活率，其中KXS-H組效果最好。但KXS-M組與KXS-H組比較差異無統計學意義，所以最終選擇開心散中劑量含藥血清用于后續實驗研究(圖2)。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 開心散不同劑量含藥血清對AD模型的NSCs存活能力的影響

3.3 開心散含藥血清對NSCs增殖的影響

如圖3A～B所示，與對照組比較，模型組神經球直徑較小。與模型組比較，KXS組神經球直徑顯著增加[(93.25±2.92)μm，P<0.01]。如圖3C～D所示，與對照組比較，模型組細胞Ki67蛋白陽性率顯著降低[(32.87±4.01)%，P<0.01]；與模型組比較，KXS組細胞的Ki67蛋白陽性率明顯升高[(48.55±1.94)%，P<0.01]。2種檢測方法說明，在增殖培養基中，開心散含藥血清能明顯促進NSCs的增殖能力。

注：A.第七天各組細胞神經球光鏡圖；B.各組細胞在第三、五、七天的神經球直徑；C.第三天各組細胞Ki67蛋白陽性表達；D.各組細胞Ki67蛋白陽性率；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 開心散含藥血清對AD模型的NSCs增殖能力的影響

3.4 開心散含藥血清對NSCs分化的影響

IF結果顯示，與對照組比較，模型組NSCs向神經元[(24.38±2.00)%，P<0.05]和少突膠質細胞[(20.26±1.06)%，P<0.01]分化比例降低。與模型組比較，KXS組NSCs分化為神經元[(31.95±0.58)%，P<0.05]的比例升高，分化為星形膠質細胞[(31.32±3.04)%，P<0.05]的比例降低，而對少突膠質細胞無顯著影響。3組細胞仍有少部分保持未分化狀態，差異無統計學意義。說明在分化培養基中，開心散含藥血清能夠拮抗Aβ誘導的NSCs向神經元分化減少、向膠質細胞分化增多的異常行為(圖4)。

注：A.第十四天NSCs分化不同類型神經細胞，NF-M+神經元、GFAP+星形膠質細胞、NG2+少突膠質細胞和Nestin+未分化NSCs均為紅色，DAPI染細胞核為藍色；B.NSCs分化成各個類型細胞的定量分析；C.第十四天各組NSCs向神經元分化；D.各組NSCs分化為神經元陽性細胞率；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。圖4 開心散含藥血清對AD模型的NSCs分化能力的影響

4 討論

Aβ作為極強的神經毒性物質，代謝異常會大量累積于神經系統，可能是AD發生和發展的始動因素[23]。研究表明，Aβ1-42可致海馬區NSCs增殖水平降低，損傷后引起明顯認知功能障礙[24]；Aβ積聚會抑制神經干/祖細胞的增殖和神經元分化，從而影響體外和體內成年海馬的神經發生[25]；Aβ通過破壞NSCs自我更新的線粒體信號，使NSCs的活性及增殖能力受到損害，并間接阻斷了神經源性分化[26]。目前針對AD的治療策略都不能從根本上補充AD發病過程中丟失的神經元。

NSCs在AD的治療中有廣泛的應用前景，NSCs與其他成體細胞的區別在于其具有分化成多種不同類型細胞的能力，其可經歷對稱或不對稱分裂成為2個子細胞。對稱分裂產生2個NSCs，而不對稱分裂產生1個NSCs和1個走向分化方向的細胞，分化的方向主要是神經元、星形及少突膠質細胞[27]。所以NSCs可以在生長過程中分化成不同的神經細胞，并且可以源源不斷的產生新的NSCs，且不會使之耗竭。

研究發現，開心散含藥血清可以保護PC12細胞[28]；通過維持線粒體正常功能抑制神經細胞凋亡[29]。目前已有的對于開心散的研究大多是從改善AD小鼠記憶、激活通路改善突觸、炎癥因子的調節等角度進行，但未見開心散含藥血清能否促進NSCs的增殖和分化繼而從根源上解決AD大量損傷及丟失的神經細胞的研究。

本實驗首先在增殖培養基中培養NSCs，檢測NSCs的存活及增殖能力，然后在分化培養基中誘導NSCs分化。Aβ1-42造模后，通過CCK-8法檢測顯示，與對照組比較，Aβ1-42損傷的NSCs存活率降低，說明符合AD細胞模型特征。與模型組比較，開心散高、中、低劑量含藥血清組細胞存活率都提高。說明開心散含藥血清可以提高AD神經干細胞存活率，發揮神經保護作用。

通過Image J測量神經球直徑可知，與模型組比較，開心散含藥血清能夠使神經球直徑顯著增加。IF檢測結果顯示，開心散含藥血清使NSCs的Ki67陽性率升高。說明開心散含藥血清能夠促進AD神經干細胞的增殖能力。

在分化培養基中，與模型組比較，開心散含藥血清促神經干細胞分化為更多的神經元和更少的星形膠質細胞，而對少突膠質細胞無影響。說明開心散含藥血清能夠拮抗Aβ1-42誘導的NSCs神經元分化較少而膠質細胞分化增強的異常行為。

本研究結果表明，開心散含藥血清能提高Aβ1-42損傷的NSCs存活率，促進其增殖，并拮抗Aβ1-42導致的NSCs神經元分化較少而膠質細胞分化增強，提示開心散具有使NSCs向有利于機體神經修復的方向發展的作用。開心散對AD模型NSCs保護作用的作用機制將在后續實驗中繼續研究。