基于網絡藥理學的黃連干預幽門螺桿菌作用機制探討△

陳秋霞，黃安，梁冬媚，龐宇舟，2*

1.廣西中醫藥大學 壯醫藥學院，廣西 南寧 530001；2.廣西壯瑤醫藥與醫養結合人才小高地，廣西 南寧 530000

幽門螺桿菌(Hp)屬于一種螺旋狀的革蘭陰性菌，可長期定植于人類胃黏膜中，是世界上最頑固的慢性致病菌之一。Hp感染不僅與胃腸道疾病相關，還可能參與消化系統外的血液系統、神經系統、內分泌系統、心血管系統及免疫系統等疾病的發生，如胃炎、胃癌、冠心病、皮膚超敏反應、骨質疏松、糖尿病等[1]。Hp感染具有感染率高、病程長、容易復發的特點，嚴重威脅患者的生命健康。西醫治療Hp主要以三聯療法或四聯療法為主，臨床上雖取得一定的療效，但由于抗菌藥物的耐藥性、患者的個體差異、藥物的不良反應及治療的不規范性等因素導致Hp的根除率有所下降[2]。因此，從中醫藥中尋求新的Hp感染抑制藥物已成為重要的研究方向。

中醫認為，Hp屬于“外來邪氣”，與濕熱病邪之間存在密切聯系。諸多實驗和臨床研究都表明，脾胃濕熱的環境下Hp感染率較高[3]。因此，清熱祛濕藥在抑制Hp方面發揮了巨大的作用。已有文獻報道，黃連有較好的抑殺Hp的作用，且與其他清熱藥比較，其對Hp多重耐藥株的最小抑菌濃度(MIC)值最小，抑菌作用強[4]。黃連抑菌的有效成分一般認為是小檗堿，其具有廣譜抗菌作用，抗菌療效明顯，抗菌機制可能是通過抑制細菌的葡萄糖及糖代謝中間產物的氧化過程，特別是脫氧反應，從而消滅細菌[5]。黃連乙醇提取液及鹽酸小檗堿的體外抗Hp實驗結果顯示，黃連與小檗堿均有抗菌活性，黃連的抗菌活性相對較好[6-7]。且黃連中黃連堿、小檗堿、巴馬汀、表小檗堿和藥根堿5種生物堿均能有效地抑制Hp的活性，抗菌作用效果依次為黃連堿、小檗堿、巴馬汀、表小檗堿、藥根堿。臨床研究顯示，小檗堿聯合鉍劑四聯療法可顯著提高Hp根除率，促進消化性潰瘍的愈合，效果優于單純鉍劑四聯療法[8]。目前，黃連或其成分干預Hp的作用機制尚不明確，可能由多種成分互相協作共同達到抗菌的效果。為此，本研究基于網絡藥理學分析黃連有效成分作用于Hp的靶點，探討其抑菌的作用機制和物質基礎，以期為Hp引起的疾病治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 黃連藥效成分篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)搜索黃連，得到黃連所有化學成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18作為篩選標準。由于其有效成分可在胃腸道內直接發揮抗Hp作用，故直接采用Perl(https：//www.perl.org/)軟件對相關有效成分作用靶點進行預測。

1.2 藥效成分靶點預測

在TCMSP數據庫中搜索黃連的相關靶點，將篩選得到的靶蛋白輸入到UniProt(ttp：//www. uniprot.org/)數據庫中，得到相應的靶點名稱，運用Perl軟件對篩選出的靶點進行注釋。

1.3 疾病靶點預測

利用GeneCards數據庫(http：//www.Genecards. org/)和OMIM數據庫(http：//www.omim.org/)，以“Helicobacterpylori”為關鍵詞進行搜索，得到與Hp相關的基因，作為疾病的候選靶點。

1.4 藥物靶點與疾病靶點交集

運用R語言軟件(https：//www.r-project.org/)構建黃連與Hp靶點之間的交集，繪制黃連與Hp靶點的韋恩圖。

1.5 構建中藥-有效成分-疾病-靶點調控網絡

利用Perl軟件將獲得的黃連-Hp靶點進行一一映射，再運用Cytoscape 3.6.1(http：//www. cytoscape. org)軟件對該網絡進行拓撲計算，得到中藥-有效成分-疾病-靶點調控網絡。網絡中的節點(node)代表化合物、關鍵靶點、信號通路、疾病等；邊(edge)代表藥物-化合物、疾病-靶點、成分-靶點之間的相互作用關系。網絡節點度(degree)值代表節點與其他節點相連接的個數或邊數。并使用R語言繪制PPI靶點條圖。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建

為探索靶點-蛋白之間的相互作用，把黃連干預Hp的相關靶點上傳至在線STRING 11.0軟件(http：//string-db.org/，ver.11.0)，獲得PPI數據，構建網絡。

1.7 基因本體(GO)功能富集與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

通過藥效成分和相關靶點預測，得到成分靶點相互作用關系和疾病靶點相互作用關系。利用R語言軟件對篩選得到的黃連干預Hp的靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。

2 結果

2.1 黃連藥效成分篩選結果

通過TCMSP數據庫查詢黃連藥效成分及作用靶點，根據OB≥30、DL≥0.18篩選共得到48個藥效成分，分別為小檗堿(berberine)、非洲防己堿(columbamine)、異香蘭素(lsovanillin)、綠原酸(heriguard)、爪哇鐮菌素(javanicin)、黃柏酮酸(obacunoic acid)、黃皮樹堿(obamegine)、花椒堿(fagarine)、2-羧甲基-3-異戊烯基-2，3-環氧-1，4-萘醌(2-carboxymethyl-3-prenyl-2，3-epoxy-1，4-naphthoquinone)、木蘭花堿(magnoflorine)、黃柏酮(obacunone)、三羥基蟾蜍甾族膽烷酸(trihydroxybufosterocholanic acid)、小檗紅堿(berberrubine)、5，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮(DPEC)、去四氫碎葉紫堇堿(corydaldine)、表小檗堿(epiberberine)、格蘭地新(groenlandicine)、檸檬苦素(limonin)、降氧化北美黃連次堿(noroxyhydrastinine)、黃柏堿(phellodendrine)、咖啡酸乙酯(ethyl caffeate)、氫化小檗堿[(R)-canadine]、小檗浸堿(berlambine)、二氫歐山芹醇當歸酸酯(zosimin)、雞冠花苷A(corchoroside A)、黃麻苷A(corchoroside A_qt)、3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙-2-烯酸(FER)、木蘭花堿(magnograndiolide)、掌葉大黃二蒽酮A(palmidin A)、6-O-E-阿魏?；罟遣荽?6-O-E-feruloylajugol)、失去糖殘基的6-O-E-阿魏酰基筋骨草醇(6-O-E-feruloylajugol_qt)、鹽酸巴馬汀(palmatine)、藥根堿(jatrorrizine)、槲皮素(quercetin)、香草酸(vanillic acid)、羥基酪醇(hydroxytyrosol)、對香豆酸(p-coumaric acid)、黃連堿(coptisine)、直鐵線蓮寧B(clemastanin B_qt)、粉防己堿(tetrandrine)、甲基黃連堿(worenine)、2，5-二羥基苯甲酸(GENOP)、原兒茶酸甲酯(methyl protocatechuate)、3，4-二甲氧基-肉桂酸[cinnamic acid，3，4-dimethoxy-(8CI)]、密花藤胺(pycnamine)、丹參素(danshensu)、穆坪馬兜鈴酰胺(moupinamide)、尖刺堿(oxyacanthine)。

2.2 藥物-疾病靶點預測結果

在TCMSP數據庫查詢到黃連靶點581個，運用Perl軟件對黃連的藥效成分進行基因靶點注釋，得到223個靶點。GeneCards數據庫和OMIM數據庫中分別檢索到Hp靶點1878個和28個，將檢索到的基因合并去除重復項后，得到黃連靶點99個和Hp靶點1819個。將所得黃連靶點與Hp靶點進行交集比對，篩選出共同靶點62個(圖1)。

圖1 黃連-Hp靶點韋恩圖

2.3 中藥-有效成分-疾病-靶點網絡構建

為了進一步分析黃連的活性成分與Hp的作用關系，利用Cytoscape 3.6.1軟件構建黃連干預Hp的有效成分與作用靶點之間的可視化網絡模型(圖2)，共得到95個節點和244條相互作用的邊。黃連主要通過31個有效成分作用于62個靶點，這62個靶點可能影響Hp的發生。

注：藍色棱形代表Hp；黃色橢圓形代表Hp的靶基因；紫色三角形代表黃連；綠色箭頭代表黃連的有效成分；紅色線條代表Hp與靶點之間的作用關系；紫色三角形代表黃連有效成分與靶點之間的作用關系；綠色線條代表黃連與其有效成分之間的作用關系。圖2 黃連干預Hp的中藥-成分-疾病-靶點調控網絡

各節點之間的連線代表這些節點元素之間的作用關系，相連的節點數目越多，這個靶點或化合物在網絡中的作用就越關鍵。由圖2可見，與HP靶點連線數目排名靠前的化合物有槲皮素、漢防己甲素、藥根堿、鹽酸巴馬汀、小檗堿、去四氫碎葉紫堇堿等，說明這些化合物在網絡中起著重要的調節作用，可能是黃連干預Hp較為關鍵的成分。且黃連有效成分較集中作用于雄激素受體(AR)、毒蕈堿型膽堿受體M3(CHRM3)、絲氨酸蛋白酶1(PRSS1)、環加氧酶1(PTGS1)、纖溶酶原激活因子(PLAU)、雌激素受體1(ESR1)、V-Rel網狀內皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)等靶點。

2.4 PPI網絡

為了更好地理解黃連干預Hp的作用機制，利用STRING 11.0數據庫構建了黃連干預Hp相關靶點的PPI網絡(圖3)。從結果可以看出，黃連的靶點蛋白之間存在廣泛的相互作用，PPI網絡包含62個蛋白質節點和467條相互作用關系(連線)。根據R語言繪制的中藥-疾病核心靶點條圖(圖4)，鄰接蛋白度值較高的有胱天蛋白酶3(CASP3)、白細胞介素-6(IL-6)、V-Myc骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(MYC)、雌激素受體1(ESR1)、細胞周期素D1(CCND1)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、Fos、V-Rel網狀內皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、雄激素受體(AR)、過氧化物酶體增生激活受體(PPARG)等，提示這些靶點在黃連抑制Hp的過程中發揮著關鍵作用。

圖3 黃連干預Hp的中藥-疾病靶點PPI網絡

圖4 黃連干預Hp的核心靶點(前30位)

2.5 GO功能富集分析

利用R語言軟件對預測出的黃連干預Hp的核心靶點進行GO功能富集分析(圖5)。黃連干預Hp的核心基因的GO功能主要涉及DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、激活轉錄因子結合、DNA結合轉錄激活活性及RNA聚合酶Ⅱ特異性、DNA結合轉錄激活活性、泛素樣蛋白連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合、谷胱甘肽結合、血紅素結合、激酶調節活性等。

圖5 黃連干預Hp靶點的GO功能富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析

構建黃連干預Hp核心靶標的KEGG 通路富集(圖6)，黃連干預Hp核心靶點的KEGG 通路主要涉及乙型肝炎信號通路、肝細胞癌信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、前列腺癌信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路、癌癥中的蛋白多糖信號通路、糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物通過和其受體結合(AGE-RAGE)信號通路、人T細胞白血病病毒1型感染信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、腫瘤壞死因子信號途徑信號通路、結直腸癌信號通路等。

圖6 黃連干預Hp靶點的KEGG通路富集分析

3 討論與結論

黃連味苦，性寒，歸心、脾、胃、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。黃連的有效成分和多數Hp靶點存在交互作用，不同的有效成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，表明黃連是通過多成分、多靶點及多通路協同作用的方式發揮干預Hp的作用。其中，槲皮素、漢防己甲素、含藥根堿、鹽酸巴馬汀、小檗堿等與Hp靶點交互作用較多，提示這些黃連的活性成分在干預Hp中發揮著關鍵作用。黃連中含有大量的小檗堿，對革蘭陽性及陰性菌均有抑菌作用，可以有效地抑制幽門螺桿菌細胞內對葡萄糖的攝取和氧化反應，從而使病菌無法得到充足的營養而凋亡，能抗消化性潰瘍、抑制胃酸分泌、保護胃黏膜，抑制Hp作用顯著[9]。槲皮素是一種含大量酚羥基的類黃酮，具有較強的清除活性氧和自由基的能力，具備抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓等生物活性[10]，其中包括對Hp酶的活性。槲皮素可通過降低p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和Bax的水平、增加Bcl-2的水平、抑制幽門螺桿菌感染相關的細胞凋亡，從而調節胃細胞增殖和凋亡的平衡[11-12]。因此，槲皮素可能是一種防治Hp引起的胃炎的潛在候選藥物。漢防己甲素又稱粉防己堿，屬于一種鈣通道阻滯劑的雙芐基異喹啉類生物堿。相關研究表明，漢防己甲素具有抑制胃癌細胞增殖，并誘導其發生凋亡和自噬、逆轉藥物抵抗的作用[13]。通過漢防己甲素對Hp靶點的作用可見，其對由Hp引起的胃部病變亦有一定的治療效果。另有研究表明，巴馬汀也是一種有效的Hp抑制劑，實驗也證明巴馬汀對4株Hp(ATCC 43504、NCTC 26695、SS1和ICDC 111001)均有抑菌作用[14]。巴馬汀還對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和超氧自由基有清除作用，對Hp定植和潰瘍產生有抑制作用，被認為是一種新型的保護劑[15]。

黃連干預Hp的核心靶點主要有CASP3、MYC、IL-6、ESR1、CCND1、ERBB2、Fos等。這些靶點可能通過影響DNA結合轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子結合、激活轉錄因子結合、DNA結合轉錄激活活性等細胞因子水平來調控Hp的發生。CASP3蛋白屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)家族，Caspase家族是一類半胱氨酸特異性蛋白酶，與細胞因子成熟和細胞凋亡有關，Caspase-3處于Caspase級聯的下游，在凋亡通路末期被激活，是細胞凋亡關鍵執行蛋白酶之一[16]。其可能參與了胃黏膜正常細胞及受損細胞的凋亡及更新，在多種細胞損傷因子如Hp感染等長期作用下，部分細胞受損，Caspase-3酶原等被損傷信號激活后參與受損細胞的清除[17]。人體出現Hp感染后可介導免疫反應及慢性炎性反應的產生，誘導大量細胞因子及炎性介質的生成。陳一等[18]研究結果表明，IL-6參與了Hp感染后的細胞免疫調節過程，IL-6可抑制Hp感染機體的細胞免疫，激活體液免疫，其水平的高低可作為判定機體免疫情況的指標。MYC即瘤細胞病毒癌基因蛋白，其既能促進細胞增殖，又可介導細胞凋亡，具有雙向調節作用。有研究發現，受Hp感染患者的胃癌前病變發生率高于正常人群，在Hp感染患者胃黏膜中C-myc蛋白陽性表達率顯著高于未感染患者，說明C-myc蛋白可能通過促進Hp的增殖對胃部產生更多的損害，與胃癌的發展息息相關[19]。此外，黃連中的有效成分還可通過調控其他分子水平對Hp起到干預作用。

在本研究篩選出的信號通路中，與黃連有效靶點的關聯度相對較高的有乙型肝炎信號通路、肝細胞癌信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路等。研究表明，Hp感染會導致慢性乙型肝炎(CHB)患者出現胃黏膜病變，乙型肝炎病毒(HBV)感染是導致CHB的直接原因，HBV除具有嗜肝性外，還具有泛嗜性，常可累及胃，同時在胃微血管內皮細胞處形成抗原抗體復合物，導致胃部組織細胞出現炎性反應，使胃黏膜屏障作用減弱而發生潰瘍等病變，且潰瘍可隨HBV的大量復制而逐漸加重[20-23]。Hp具有肝細胞毒性，與慢性肝病進展和肝癌的發生有一定相關性。Hp感染后可誘導一系列的細胞因子上調并構成一個復雜炎癥調節網絡。多種炎癥細胞因子可促進肝內炎癥反應，介導肝細胞損傷，誘導各類細胞分化增殖，從而使肝臟慢性炎癥持續存在，在一定程度上可誘導肝癌的發生[24]。而黃連有效成分可以通過靶點抑制Hp或阻斷細胞因子，對抑制肝細胞損傷有重要意義。此外，剪切應力信號轉導涉及細胞膜表面和胞漿內信號轉導途徑的活化，可通過誘導生長阻滯蛋白的產生和抑制內皮細胞周期[25]。Hp感染會引發、加重患者的炎癥反應，改變其血清脂質代謝平衡，進而促進內皮損傷、動脈硬化[26]。因此，對動脈斑塊患者行抗Hp治療可更好地改善頸動脈斑塊形態學血流動力學指標及血脂異常。

綜上所述，黃連多種有效成分通過調控Hp相關的基因起到干預Hp的作用。本研究可為黃連干預Hp提供一定的依據，也可為臨床干預Hp及新型藥物的開發提供思路。但本研究主要是借助網絡藥理學方法分析預測黃連干預Hp可能存在的靶點、通路等，尚存在一些不足之處，若需明確黃連的有效成分對Hp靶點的作用機制或發現新的靶點及藥效成分，還需進一步的實驗驗證。