基于網絡藥理學的柴胡疏肝散治療失眠作用機制探討△

唐秀松，陳靜，方剛，黃安，陳煒

1.廣西中醫藥大學 廣西壯醫應用基礎研究重點應驗室，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學 第一附屬醫院，廣西 南寧 530023

失眠(insomnia)是睡眠障礙中的一種常見類型，主要表現為入睡困難、睡眠維持障礙、早醒、睡眠質量下降和總睡眠時間減少，同時伴日間功能障礙。失眠具有高患病率、高復發率、病情反復難愈等特點[1]。長期失眠不僅會影響人們正常的工作和生活，還會增加罹患各種疾病的風險，甚至可能引發惡性意外事故。目前臨床治療失眠藥物主要包括苯二氮卓類受體激動劑、褪黑素受體激動劑、食欲素受體拮抗劑和具有催眠效應的抗抑郁藥物。其中以苯二氮卓類為主，該類藥物起效快，能幫助患者快速入睡，但其具有成癮性、撤藥困難、不良反應大、遠期效果不顯著等不足。非藥物治療方法有睡眠教育、認知治療、行為治療、音樂治療等[2]。自古以來，中醫學對于失眠的治療具有專方專藥，如酸棗仁湯、黃連阿膠湯、交泰丸等。在結合辨證論治、三因制宜的基礎上，開立的處方往往能取得不錯的療效，并且具有不良反應小、停藥容易、療效穩定的優點。

柴胡疏肝散記載于《景岳全書·古方八陣·散陣》[3]，該方由柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草組成，具有奏疏肝行氣、活血止痛之功，常用于治療肝郁氣滯的病癥，如慢性肝炎和胃炎、肋間神經痛、失眠、焦慮抑郁癥、斑禿、婦科和男科疾病等[4]?，F代藥理研究表明，柴胡疏肝散能上調圍絕經期綜合征肝郁證大鼠、阿爾茨海默病大鼠和抑郁模型大鼠海馬組織的5-羥色胺、去甲腎上腺素和多巴胺水平，改善學習記憶能力和抑郁狀態[5-7]；上調腦源性神經營養因子及其受體酪氨酸激酶受體B mRNA水平[8]；增加肝郁大鼠海馬磷酸二酯酶-4及其亞型的mRNA的表達[9]；調節內分泌[包括下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸、下丘腦-垂體-甲狀腺素(HPT)軸、下丘腦-垂體-卵巢(HPO)軸][10-12]；提高免疫力[13-15]；抗氧化[16-17]等。大量臨床研究表明[18-24]，單獨的柴胡疏肝散或柴胡疏肝散聯合其他藥物治療肝郁氣滯型的失眠療效顯著，但未明確指出該方治療失眠的作用機制。

網絡藥理學主要以“藥物-靶點-疾病”相互作用網絡為特征，其系統性的研究與中醫學的“整體觀念”一致[25]。本研究采用網絡藥理學方法，深入探討該方治療失眠的作用機制，以期為其臨床應用及后續實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 柴胡疏肝散藥物有效成分的篩選及相關靶點的收集

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分別輸入柴胡疏肝散中7味中藥名稱，即柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草，搜索7味中藥有效成分，通過口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進行篩選。同時在TCMSP平臺Relate Targets欄目中直接收集柴胡疏肝散中7味中藥的相關靶點。

1.2 柴胡疏肝散靶點基因注釋

應用UniProt蛋白數據庫(https：//www.uniprot. org/)和Perl 5.26.3軟件(https：//www.perl.org/get.html)對獲取的柴胡疏肝散所有相關靶點進行注釋，獲得柴胡疏肝散對應的相關基因，以備后序分析。

1.3 失眠相關疾病靶點獲取

以“insomnia”作為關鍵詞，在GeneCards數據庫(https：//genealacart.genecards.org/)和OMIM數據庫(https：//www.omim.org/)進行檢索，并下載失眠的疾病靶點，綜合后去除其中的重復靶點，最終得到失眠疾病相關靶點。

1.4 繪制韋恩圖

運用R 3.6.3軟件(https：//www.r-project.org/)中的VennDiagram程序包對獲得的柴胡疏肝散藥物靶點和失眠疾病靶點進行分析處理，最終得到藥物與疾病之間的共同靶點，并繪制韋恩圖。

1.5 成分-靶點網絡構建

利用Cytoscape 3.7.2軟件(https：//cytoscape.org/)對所獲得的柴胡疏肝散有效成分、交集靶點進行計算分析，構建柴胡疏肝散有效成分-失眠調控網絡。

1.6 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

將柴胡疏肝散與失眠的交集靶點導入STRING 11.0(https：//string-db.org/)網站，限定研究物種為“Homo sapiens”，將網絡中無關或游離蛋白去掉，余參數按照默認設定值，最終得到柴胡疏肝散治療失眠的PPI網絡。

1.7 PPI網絡核心蛋白生物功能注釋分析

將獲得的PPI網絡中的核心蛋白導入功能注釋(functional annotation)工具DAVID(https：//david. ncifcrf. gov/)，限定研究物種為人類(Homo sapiens)，選擇基因本體(GO)分析下的分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞組成(CC)部分進行GO富集分析，選擇Pathway分析中京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析，設定P<0.01，進一步尋找有效成分靶點顯著富集的主要功能與體內通路，最后利用Cytoscape 3.7.2軟件clue GO插件繪制條形圖展示富集結果。

1.8 KEGG-PPI網絡核心蛋白關系網絡構建

利用KEGG數據庫中的KEGG Mapper工具，將前述方法所得的核心蛋白對應的UniProt ID導入其中，并限定研究物種為“Homo spiens”，獲得柴胡疏肝散治療失眠的作用通路，篩選與上述靶點有關的通路，整合得到最終的通路。并利用Cytoscape 3.7.2構建KEGG-PPI網絡核心蛋白關系網絡。

2 結果

2.1 柴胡疏肝散活性成分篩選結果

結果顯示，共得到柴胡疏肝散157個有效成分，8488個潛在靶點，去除重復的靶點后共獲得240個藥物相關靶點。因柴胡疏肝散有效成分較多，只展示OB≥60%的活性成分(表1)。

表1 柴胡疏肝散活性成分(OB≥60%)

續表1

2.2 失眠疾病靶點及交集靶點篩選

在GeneCards數據庫中搜集到失眠的疾病靶點有2280個，在OMIM中得到失眠的疾病靶點3個。通過R軟件分析柴胡疏肝散藥物靶點240個與失眠疾病靶點2283個，得到藥物-疾病共同靶點91個，繪制韋恩圖(圖1)。

圖1 柴胡疏肝散與失眠交集靶點韋恩圖

2.3 成分-靶點網絡構建

通過Cytoscape 3.7.2軟件進行計算分析，得到柴胡疏肝散有效成分-失眠疾病靶點的調控網絡圖(圖2)。

注：正方形代表藥物有效成分，其中綠色為柴胡，灰色為陳皮，深紫色為甘草，深藍色為白芍，淺綠色為香附，紫色為枳殼，黃色為共有的成分；棕色三角形代表柴胡疏肝散與失眠的91個交集基因。圖2 柴胡疏肝散治療失眠的成分-靶點網絡

2.4 PPI網絡構建

通過借助STRING在線網站，按照網站默認設置參數值，對柴胡疏肝散與失眠的交集靶點進行分析，得到PPI網絡(圖3)。其中作用強度排名前30位的核心靶點見圖4，包括白細胞介素-6(IL-6)、蛋白激酶B1(Akt1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、Fos、過氧化氫酶(CAT)、環磷酸腺苷(cAMP)反應元件結合蛋白1(CREB1)等。

圖3 柴胡疏肝散-失眠PPI網絡

圖4 柴胡疏肝散-失眠PPI網絡核心靶點

2.5 GO富集分析

GO功能富集分析結果顯示，BP、CC和MF相關條目分別為1624、62、97條。根據P值排序，每個模塊展示前20位的條目(圖5)。其中BP主要涉及對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、對金屬離子的響應、循環系統中的血管過程、應答輻射、對抗生素的反應等。CC主要包括突觸后膜的組成成分、突觸后膜固有成分、突觸膜的組成成分、突觸膜內成分、突觸前膜的組成成分、脂筏、膜微區、膜區、突觸前膜固有成分、突觸前膜等。MF主要集中在腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合、G蛋白偶聯胺受體活性、銨離子結合、血紅素結合、四吡咯結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、神經遞質受體活性、多巴胺結合、細胞因子活性等。

圖5 柴胡疏肝散-失眠PPI網絡核心蛋白GO功能分析

2.6 KEGG富集分析

KEGG通路富集分析得到103條通路，主要包括糖基化終產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、前列腺癌通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、內分泌抵抗通路、多巴胺能突觸、IL-17信號通路、催乳素信號通路等。根據P值大小，排列前20位的通路見圖6。

圖6 柴胡疏肝散-失眠PPI網絡核心蛋白KEGG功能富集分析

2.7 KEGG-PPI網絡核心蛋白關系

KEGG-PPI網絡核心蛋白關系網絡(圖7、表2)中包括20條通路和富集在這些通路上的55個蛋白。從圖中可知，與IL-6、Akt1、MAPK14、VEGFA、Fos等靶點相連的通路較多。hsa04933、hsa05418、hsa04668、hsa05167等通路上相關聯的靶點較多。

注：紫色橢圓形表示通路；黃色三角形表示靶點；圖形越大，說明鄰接節點數目越多。圖7 KEGG-PPI網絡核心蛋白關系網絡

表2 KEGG-PPI網絡核心蛋白關系網絡信息

3 討論

失眠在中醫屬于“不寐”“不得眠”“目不瞑”“不得臥”等范疇，病位在心，與肝脾腎相關，基本病機為陽不入陰。失眠的病因很多，涉及肝陽擾動、思慮過度、內傷心脾、陽不交陰、陰虛火旺、心腎不交等[26]。醫者常四診合參，進行辨證施治。

柴胡疏肝散由柴胡、香附、川芎、陳皮、枳殼、白芍、甘草7味藥組成。君藥柴胡主要化學成分柴胡皂苷具有鎮靜、解熱、提高免疫、抗炎、抗病毒、護肝、抗腫瘤等作用[27]。柴胡皂苷能夠使貓的慢波睡眠Ⅱ期和快動眼睡眠期顯著增加，睡眠時間延長[28-30]。白芍提取物白芍總苷可延長正常大鼠慢波睡眠的持續時間，使失眠大鼠的睡眠參數恢復正常[31]。文獻報道，香附揮發油對促硝西泮、苯二氮類藥物有明顯的促透皮作用[32-33]。香附揮發油可能是通過平衡中樞膽堿能系統上調5-羥色胺水平，改善焦慮小鼠的癥狀[34]。枳殼提取物具有抗抑郁的作用[35-36]。炙甘草中含有較多的甘草總黃酮、甘草苷，常被用于抑郁癥的治療[37]。甘草黃酮提取物可通過抑制皮質醇升高、調節HPA軸起到預防和治療抑郁癥[38]。該方各藥均對睡眠有一定的改善作用。

柴胡疏肝散治療失眠的成分-靶點網絡顯示，IL-6、Akt1、VEGFA、Fos、CAT可能為柴胡疏肝散治療失眠的核心靶點。研究表明，失眠與炎性因子表達上升密切相關，當人體睡眠被剝奪后，炎性反應因子水平直線增高[39]。增高的時間以下午至睡前明顯，其中IL-6的水平與睡眠覺醒時間呈正比，與非快速眼動相睡眠和睡眠質量呈反比[40]。作為炎癥反應根源的白細胞介素類細胞因子會造成越來越多的炎性介質釋放，破壞正常的睡眠節律，最終出現失眠[41]。而且由細胞因子組成的神經遞質免疫系統可通過擾亂血液、神經等的正常狀態，進而影響睡眠質量[42]。睡眠障礙的治療效果及預后的評估可通過監測血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平，這些因子會通過不同途徑影響睡眠進程[43]。應用疏肝解郁法治療肝郁型圍絕經期失眠女性患者，結果表明，治療后患者的IL-6水平下調，睡眠質量提高[44]。肝郁分級與Akt蛋白及mRNA水平呈中度正相關，圍絕經期婦女非器質性失眠可能是由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路介導的，應用PI3K/Akt信號通路抑制劑治療是該類疾病今后研究的方向[45]。VEGFA基因在致死性家族失眠癥(FFI)患者腦組織基因表達譜中是上調的基因[46]。Fos又稱c-Fos，是一種原癌基因，參與細胞生長、分化、信息傳遞及動物的學習和記憶和維持的清醒。褪黑素能有效調節大鼠的晝夜節律，改善睡眠質量[47-48]。哺乳動物視交叉上核中c-Fos基因的表達水平與年齡呈負相關，可反映睡眠質量和晝夜節律，是晝夜節律的關鍵基因，睡眠被剝奪后c-Fos基因表達會增加[49-52]。

PPI結果顯示，柴胡疏肝散抗失眠的關鍵蛋白包括IL-6、Akt1、VEGFA、Fos、CAT、CREB1等，這些關鍵靶點參與脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應、突觸膜的組成成分、突觸膜內成分、突觸前膜的組成成分、脂筏、膜微區、膜區、腎上腺素能受體活性、兒茶酚胺結合、G蛋白偶聯胺受體活性、銨離子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、神經遞質受體活性、多巴胺結合、細胞因子活性等生物學過程，參與AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、TNF信號通路、前列腺癌通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染通路、內分泌抵抗通路、多巴胺能突觸通路、IL-17信號通路、催乳素信號通路等的調控。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學方法探討柴胡疏肝散治療失眠的作用機制，從整體上分析柴胡疏肝散和失眠的關系，為柴胡疏肝散相關的分子生物學研究及更深入的藥理學探索提供了參考。但本研究未能對各味中藥的劑量加以考慮，這將是以后網絡藥理學及相關研究需要關注的問題。