基于HPLC指紋圖譜的60Co-γ輻射滅菌對虎杖有效成分的影響研究

丁偉，何潔，黃東萍，緱慧君

陜西省漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000

虎杖為蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根莖和根，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效，主產于江西、四川、山東、江蘇等地，中醫臨床用于治療濕熱黃疸、淋濁、帶下、風濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、跌打損傷、肺熱咳嗽等。其主要活性成分為蒽醌類、二苯乙烯類、苯丙素類及黃酮類等[1-3]。槲皮素是黃酮類抗氧化劑和自由基清除劑，對卵巢衰老有保護作用，可提高卵巢的抗氧化能力，同時具有抗腫瘤活性[4-5]。虎杖苷和白藜蘆醇是二苯乙烯類化合物，可改善心肌損傷，具有保護血管、調血脂、抗血栓等作用[6-7]。大黃素和大黃素甲醚是蒽醌類化合物，大黃素對急性髓系白血病細胞有抑制作用[8]；大黃素甲醚對人體黑色素瘤、乳腺癌抑制作用較強[9-10]。

60Co-γ輻射滅菌是通過特定的方式控制微生物生長或殺死微生物的一種滅菌方法，廣泛應用于中藥飲片和中成藥的生產滅菌，相比傳統滅菌方法具有穿透力強、滅菌效果好、經濟安全、無輻照殘留等優點，尤其適用于熱敏性物料及揮發性成分的滅菌[11-13]。中藥一般來源于天然植物、動物及礦物，微生物含量高，滅菌是中藥生產過程中的重要環節。中藥成分具有復雜性和多樣性，因此在保證藥品“安全、有效、穩定”的原則下，如何因藥制宜地選擇滅菌方式尤為重要。60Co-γ輻照是中藥滅菌的輔助手段。為加強中藥輻照滅菌質量管理，原中華人民共和國衛生部于1997年頒布了《60Co輻照中藥滅菌劑量標準》(內部試行)，并列出198種允許輻照滅菌的中藥、5種允許低劑量(3 kGy)輻照滅菌藥材品種、2種不允許輻照的藥材品種及70種允許輻照的中成藥品種，原則上未列入名錄的品種不允許輻照滅菌。2015年11月9日原國家食品藥品監督管理局頒布了《中藥輻照滅菌技術指導原則》(以下簡稱《指導原則》)，規定中藥采用輻照滅菌應充分系統說明其必要性?！吨腥A人民共和國藥典》2020年版規定“不受輻射破壞的原料藥及成品”列入可輻照的范圍?；⒄茸鳛閭鹘y中藥，臨床應用廣泛，因此虎杖飲片及以虎杖原料生粉入藥的制劑如疏風活絡丸，在生產中仍存在輻照滅菌的需求，但虎杖及含虎杖制劑并未列入《60Co輻照中藥滅菌劑量標準》允許輻照滅菌的中藥品種名錄，且尚未發現有關采用60Co-γ輻照滅菌虎杖藥材的研究報道。因此，為考察60Co-γ輻照對虎杖滅菌的可行性，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)建立虎杖指紋圖譜，并定量分析槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚5個成分含量，考察不同輻照劑量對其的影響，以期為虎杖及相關制劑采用60Co-γ輻照滅菌提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀[包括四元泵、二極管陣列檢測器(DAD)，日本島津公司]；CPA225D型電子天平(0.01 mg，德國賽多利斯公司)；60Co-γ射線輻照設備(咸陽華科輻照技術有限公司)；KQ-800E型數控超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品虎杖苷(批號：11575-201603，純度：87.36%)、槲皮素(批號：100081-201509，純度：98.6%)、大黃素(批號：110756-201512，純度：98.7%)、大黃素甲醚(批號：110758-201817，純度：99.2%)均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品白藜蘆醇(批號：150122，純度≥98%)購自成都克洛瑪生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，美國天地有限公司；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

虎杖飲片為市售，購于安徽亳州藥材市場，批號分別為20170512、20170619、20170625、20170922、20170930、20171104、20180514、20180528、20180610、20180722、20181011、20181017、20181104、20181127、20190527，編號S1～S15。《指導原則》規定中藥60Co-γ射線輻射滅菌劑量應不大于10 kGy，故分別以0(樣品編號S1～S15)、3(處理后樣品編號為S16～S30)、6(處理后樣品編號為S31～S45)、10(處理后樣品編號為S46～S60)kGy劑量輻照處理樣品。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚適量，以甲醇為溶劑配制成質量濃度分別為214.2、523.3、359.2、704.2、439.2 μg·mL-1的混合對照品溶液，經0.45 μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.1.2供試品溶液的制備 取虎杖藥材約10 g，粉碎，過二號篩，取細粉約1.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，密塞并精密稱定，超聲1 h(功率為250 W；頻率為40 kHz；水溫為30 ℃)，放冷至室溫，用甲醇補足減少的質量，搖勻，靜置，取上清液，經0.45 μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.2 色譜條件及系統適用性檢測

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～7 min，6%A；7～21 min，6%～13%A；21～30 min，13%～45%A；30～48 min，45%～60%A；48～56 min，60%A；56～60 min，60%～6%A；60～63 min，6%A)；檢測波長：254、303 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL[14-16]。取2.1.1項下混合對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件分析。結果表明，各色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，理論塔板數按虎杖苷計>5000，連續進樣5針，各組分色譜峰峰面積的RSD均小于2.0%，系統適用性良好。

2.3 HPLC指紋圖譜研究

2.3.1精密度試驗 取虎杖藥材粉末(S1)，精密稱定，按2.1.2項下供試品溶液方法處理，按2.2項下色譜條件分析，連續進樣6次，記錄色譜圖。以8號色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積及相對保留時間RSD均小于1.53%，表明儀器精密度良好。

2.3.2穩定性試驗 取虎杖藥材粉末(S1)，按2.1.2項下供試品溶液方法處理，分別放置0、4、8、16、24、48 h，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖。以8號色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積及相對保留時間RSD均小于2.74%，表明供試品溶液在室溫條件下48 h內穩定。

2.3.3重復性試驗 取虎杖藥材粉末(S1)6份，每份約1.0 g，精密稱定，按2.1.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖。以8號色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積及相對保留時間RSD均小于2.33%，表明方法重復性良好。

2.3.4虎杖指紋圖譜的建立 取60批經0、3、6、10 kGy輻照處理的虎杖供試品適量，按2.1.2項下供試品溶液方法處理，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖。分別將不同劑量處理的15批色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)軟件，建立指紋圖譜，設置時間窗為0.5 min，采用中位矢量法多點校正，全譜段峰匹配，生成對照圖譜。指紋圖譜及共有模式見圖1。

圖1 不同劑量輻照虎杖HPLC指紋圖譜

2.3.5指紋圖譜共有峰指認及相似度評價 經0、3、6、10 kGy輻照處理的虎杖指紋圖譜中可確定13個色譜峰為虎杖共有指紋峰，與2.1.1項下對照品比對，確認峰4為槲皮素、峰7為虎杖苷、峰8為白藜蘆醇、峰11為大黃素、峰13為大黃素甲醚。其中，8號峰白藜蘆醇與相鄰色譜峰分離度較好，保留時間居中且穩定，故以8號峰白藜蘆醇為參照峰。

將不同輻照劑量下的虎杖藥材指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012版)軟件，以0 kGy輻照樣品圖譜作為參照圖譜，設置時間窗為0.5 min，采用中位矢量法多點校正，全譜段峰匹配，生成對照圖譜，計算各圖譜與對照指紋圖譜的相似度，結果見表1。由表1可知，樣品相似度均為0.803～1.000，表明虎杖藥材在4種輻照劑量下整體穩定性較好，指紋圖譜無色譜峰丟失或增加。

表1 不同劑量輻照虎杖HPLC指紋圖譜相似度

2.4 虎杖中5個成分定量分析

2.4.1系統適用性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、虎杖供試品溶液(S1)、空白溶液各20 μL，按2.2項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結果，理論塔板數按虎杖苷色譜峰計>5000；槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度均大于1.5，5個化學成分對稱因子均在0.95～1.05，表明該方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.空白溶劑；4.槲皮素；7.虎杖苷；8.白藜蘆醇；11.大黃素；13.大黃素甲醚。圖2 虎杖樣品及對照品HPLC圖

2.4.2線性關系考察 精密量取混合對照品溶液0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，分別用甲醇稀釋成含槲皮素質量濃度分別為4.28、21.42、42.84、85.68、171.36、214.20 μg·mL-1，虎杖苷質量濃度分別為10.47、52.33、104.66、209.32、418.64、523.30 μg·mL-1，白藜蘆醇質量濃度分別為7.18、35.92、71.84、143.68、287.36、359.20 μg·mL-1，大黃素質量濃度分別為14.08、70.43、140.84、281.68、563.36、704.20 μg·mL-1，大黃素甲醚質量濃度分別為8.78、43.92、87.84、175.68、351.36、439.20 μg·mL-1的系列混合對照品溶液，搖勻，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖。以各對照品質量濃度為橫坐標(X)，色譜峰峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，并計算相關系數。取混合對照溶液，甲醇作為稀釋溶劑，配制不同質量濃度混合對照品溶液，按2.2項下色譜條件分析，取信噪比(S/N)=10時的質量濃度為定量限，S/N=3時的質量濃度為檢測限(LOD)。結果見表2。

表2 虎杖中5個成分線性回歸方程

2.4.3精密度試驗 取2.1.2項下供試品溶液(S1)，按2.2項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。結果槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚峰面積RSD分別為0.28%、0.12%、0.43%、0.20%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.4.4穩定性試驗 取2.1.2項下虎杖供試品(S1)溶液，分別放置0、4、8、16、24、48 h，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖。結果表明，槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.66%、0.78%、0.54%、0.93%和0.82%，供試品溶液在室溫條件下48 h內穩定。

2.4.5重復性試驗 取虎杖供試品(S1)6份，按2.1.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖。結果表明，槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚的質量分數平均值分別為2.57、6.28、4.31、8.45、5.27 mg·g-1，RSD分別為1.15%、0.74%、1.52%、1.36%、1.41%，結果表明方法重復性良好。

2.4.6加樣回收率試驗 取虎杖供試品(S1)9份，每份約0.5 g，分為3組，每組3份，精密稱定，每組按槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚含量的80%、100%和120%精密加入對照品，按2.1.2項下供試品溶液制備方法處理，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖并計算各有效成分加樣回收率。結果見表3。

表3 虎杖中5個成分的加樣回收率試驗結果

2.4.7樣品測定 分別取15批經0、3、6、10 kGy劑量輻照處理的虎杖供試品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件分析，記錄色譜圖，計算5個成分含量，結果見表4。

表4 虎杖中5個成分含量測定結果 mg·g-1

3 討論

3.1 輻照劑量的選擇

本研究考察60Co-γ輻照滅菌對虎杖其指紋圖譜及化學成分的影響，參考《指導原則》建議中藥最大總體平均輻照滅菌劑量原則上不得超過10 kGy及盡可能采用低劑量輻照滅菌的原則，選定3、6、10 kGy 3個劑量對虎杖進行輻照處理。結果表明，經不同劑量輻照處理后的虎杖樣品指紋圖譜共有峰數量沒有變化；經3、6 kGy輻照處理后的樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均大于0.96，而經10 kGy輻照處理后的樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度平均值僅為0.829；采用SPSS 22.0軟件對5個化學成分的含量采用獨立樣本t檢驗分析，分別比較5個化學成分經3、6、10 kGy輻照滅菌后與未輻照滅菌樣品的含量差異是否具有統計意義。結果顯示，輻照劑量為6 kGy及以下時5個化合物含量差異無統計學意義，當劑量達到10 kGy時，大黃素甲醚平均含量較0 kGy時降低8.33%(P<0.05)。大黃素甲醚是蒽醌類成分，分子結構中含有苯甲氧基，在γ射線的作用下易發生氫化反應，降低了抗輻照穩定性[17]。

3.2 色譜條件的優化

分別考察了乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液3種流動相系統，結果表明，乙腈-0.05%磷酸溶液基線平穩、色譜峰豐富、分離效果好，因此確定乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脫為虎杖指紋圖譜及5個化學成分檢測的流動相。采用DAD檢測器在190～400 nm全波長掃描，結果表明，槲皮素、虎杖苷和白藜蘆醇在303 nm處、大黃素和大黃素甲醚在254 nm處有最大吸收，因此采用303 nm(0～35 min)、254 nm(35～63 min)不同時段波長切換法作為虎杖指紋圖譜分析及5 個成分含量測定的檢測波長。

4 結論

本研究建立的指紋圖譜及含量測定方法經方法學驗證，可用于分析不同輻照滅菌劑量虎杖藥材指紋圖譜和槲皮素、虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、大黃素甲醚5個化學成分含量測定。研究結果顯示，60Co-γ輻照滅菌劑量不超過6 kGy，對虎杖藥材指紋圖譜和5個化合物含量影響差異無統計學意義，可為虎杖采用60Co-γ輻照滅菌可行性提供理論參考。