枸杞水提取物中37種農藥殘留檢測及其風險評估△

甘龍，李晨晨，薛健，潘瑞樂

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

枸杞子為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實，具有滋補肝腎、益精明目等功效，對虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽萎遺精、內熱消渴、血虛萎黃、目昏不明等有一定的改善作用[1]。作為著名的藥食同源物質，枸杞子作為食品補充劑出口至美國、歐洲等地。據統計，枸杞子年平均出口量超過8000 t，涉及105個國家和地區[2]。在我國，枸杞子是重要的保健食品和中成藥原料。截至2020年9月，在國家食品藥品監督管理局國產保健食品數據庫登記注冊的16 549種保健食品中，含枸杞子的產品達1645種，約占總數的10%；在中成藥處方數據庫中，以其作為配方組分的中成藥處方超過總量的5.5%。

隨著枸杞子需求量逐年增加，其種植面積不斷擴大，蚜蟲、癭蚊、實蠅等病蟲害對枸杞的危害日益嚴重[3]。新煙堿、有機磷、擬除蟲菊酯等各類農藥在枸杞的種植過程中均有使用，這使得枸杞子的農藥殘留問題日益嚴重[4]。目前，文獻報道使用氣相色譜、氣相色譜-串聯質譜、液相色譜-串聯質譜、熒光檢測等多種分析手段建立枸杞子藥材的農藥殘留檢測方法，并發現其中殺蟲脒、多菌靈、克百威等多種農藥殘留超標的問題[5-11]。

枸杞子直接食用時，最常見的形式是泡茶或水煮煲湯等；作為保健食品或中成藥原料時，多采用水提取工藝處理[12]。此外，枸杞子水提取物還作為配方顆粒用于中藥復方。然而，枸杞子經水提取后農藥殘留是被富集還是減少尚缺乏深入研究，對枸杞子水提取物的農藥殘留檢測方法及其膳食暴露風險評估也未見報道。

本研究從《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版規定的禁用或限用農藥種類、近5年枸杞子出口美國被美國國家食品藥品監督管理局(FDA)自動扣留或退回的枸杞子中涉及的農藥種類及文獻報道中枸杞子農藥殘留高頻檢出或超標的種類中篩選出37種農藥，建立枸杞子水提取物的液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)檢測方法，并對市場隨機購買的有機級、綠色級、無公害級、普通級4種不同等級的枸杞子及其水提取物進行農藥殘留量檢測和風險評估，為枸杞子的食用、藥用安全提供參考。

1 材料

1.1 試藥

石墨化碳氨基復合固相萃取柱[Carb-NH2，500 mg·(6 mL)-1]、親水親脂平衡固相萃取柱[HLB，200 mg·(6 mL)-1]均購于天津博納艾杰爾公司；37種農藥對照品溶液(多菌靈、甲胺磷、涕滅威亞砜、久效磷、涕滅威砜、殺蟲脒、3-羥基克百威、涕滅威、甲磺隆、克百威、苯線磷砜、胺苯磺隆、甲拌磷亞砜、內吸磷、特丁硫磷亞砜、三唑醇、甲拌磷砜、水胺硫磷、殺撲磷、蟲螨畏、苯線磷、滅線磷、特丁硫磷砜、馬拉硫磷、三唑磷、氯唑磷、殺螟硫磷、硫線磷、蠅毒磷、甲基異柳磷、治螟磷、地蟲硫磷、甲拌磷、毒死蜱、克螨特、甲氰菊酯、噠螨靈，質量濃度均為100 μg·mL-1，農業部環境保護科研監測所)；甲酸、乙腈(質譜級，Fisher公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏公司)。枸杞子為市售商品，具體信息見表1。

表1 枸杞子樣品信息

1.2 儀器

LC-20A Prominence UFLCXR型液相色譜儀(日本島津公司)；QTRAP 5500型質譜儀(美國AB Sciex公司)；Voterx-5型渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；ME-104E型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；N-1100型旋轉蒸發儀(日本東京理化器械株式會社)；2-6型臺式低速離心機(上海托莫斯科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 混合對照品溶液制備

分別精密吸取各農藥對照品溶液500 μL，置100 mL量瓶中，乙腈定容至刻度，搖勻，密封，-18 ℃避光保存，作為混合對照品母液使用。

2.2 枸杞子提取物制備

參考文獻[13]農藥殘留檢測方法，對購買的不同等級枸杞子進行測定，選擇測定結果中不含本研究37種目標農藥的樣品作為空白樣品。

取空白樣品粉末100 g，加入蒸餾水800 mL，浸泡30 min，加熱回流提取1 h，濾過；濾渣復提1次，濾過，合并濾液，濃縮、低溫干燥，即得空白枸杞子水提取物(GOJI-kb)。

不同等級枸杞子提取物的制備：分別取不同等級枸杞子粉末100 g，同空白枸杞子提取物制備方法。分別得有機食品級枸杞子提取物(GOJI-a)、綠色食品級枸杞子提取物(GOJI-b)、無公害食品級枸杞子提取物(GOJI-c)、普通食品級枸杞子提取物(GOJI-d)。

2.3 不同前處理方法供試品溶液制備

取GOJI- kb粉末適量，準確加入混合對照品溶液，等量遞增法混合均勻，揮干溶劑，制得各農藥殘留量為20 ng·g-1的加標樣品，參考《中國藥典》2020年版[14]對不同樣品前處理方法[直接提取法(direct extraction)、快速樣品處理法(QuEChERS)、分散固相萃取法(dispersive solid-phase extraction，dSPE)、親水親脂平衡固相萃取法(HLB SPE)、石墨化碳氨基復合固相萃取法(Carb-NH2SPE)]進行比較及參數優化。

2.4 檢測條件

2.4.1色譜條件 色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；柱溫：30.0 ℃；流動相：乙腈(含0.1%甲酸，A)-水(含0.1%甲酸，B)，梯度洗脫(0～0.5 min，25%A；0.5～4.0 min，25%～30%A；4.0～8.0 min，30%～55%A；8.0～10.0 min，55%～75%A；10.0～15.0 min，75%～95%A；15.0～15.2 min，95%～25%A；15.2～18.7 min，25%A)；流速：0.20 mL·min-1；進樣量：2 μL。

2.4.2質譜條件 以三重四級桿串聯質譜儀檢測，電噴霧離子源(ESI)，監測模式為多反應監測(MRM)；掃描模式：正離子掃描；多反應監測時間窗(MRM detection window)：90 s，掃描時長(target scan time)：0.9 s，離子噴霧電壓(IS)：+5.5 kV；射入電壓(EP)：10 V；碰撞室射出電壓(CXP)：9 V；離子源溫度：550 ℃，霧化氣(GS1)：344.75 kPa，輔助氣(GS2)：344.75 kPa，氣簾氣(CUR)：137.9 kPa。各化合物監測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)見表2。

表2 枸杞水提取物中37種農藥質譜信息

3 結果

3.1 樣品前處理方法

以加樣回收率(60%～120%為合格)、試劑用量、處理步驟等作為評估指標，如表3所示，dSPE合格的農藥品種數目最多且分析周期短、試劑用量少，可作為進一步優化的基質凈化方法。最終確定的樣本前處理方法：將提取物粉碎，過三號篩，精密稱取1.5 g，置帶蓋離心管中，加入蒸餾水10 mL，渦旋混勻后靜置30 min，準確加入含1%冰醋酸的乙腈溶液10 mL，渦旋3 min，加入萃取鹽包(其中包含無水乙酸鈉1 g、無水硫酸鎂4 g)，渦旋混勻后4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為11.0 cm)，精密吸取上清液5 mL，置于預先裝有凈化材料(無水硫酸鎂600 mg，ODS C18300 mg，GCB 120 mg)的帶蓋離心管中，渦旋3 min 使充分混勻，凈化完全，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為11.0 cm)，上清液經0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

表3 5種前處理方法不同指標結果

3.2 方法學驗證

參考《中國藥典》2020年版[14]，對2.4、3.1項下所述的樣品前處理及檢測方法進行方法學驗證，37種農藥基質匹配標準溶液總離子流色譜圖見圖1，各農藥色譜峰峰形較好。

圖1 37種農藥基質匹配標準溶液總離子流色譜圖

除殺螟硫磷(15%)外，其他精密度RSD均小于6%；重復性RSD均小于10%；除多菌靈(63%)外，其他加樣回收率為75%～115%；37種農藥在0.001～0.100 mg·kg-1線性關系良好，除殺螟硫磷r為0.975，其他r均大于0.99，滿足農藥殘留最大限度測定要求(表4)。

表4 枸杞水提取物中37種農藥方法學驗證結果

3.3 不同等級枸杞子提取物農藥殘留量測定

分別將枸杞子水提取物(GOJI-a、GOJI-b、GOJI-c、GOJI-d)按3.1、2.4項下方法進行處理和測定，結果見表5。經水提取后，各提取物中農藥殘留總量均有不同程度的降低，其中，殺蟲脒、甲拌磷亞砜、克螨特均未被檢出，但克百威(含3-羥基克百威)的殘留量相對于枸杞子有略微升高。不同等級枸杞子農藥殘留檢測結果為參考文獻[13]農藥殘留測定方法，在篩選枸杞子空白藥材時測定，結果見表5。

表5 不同等級枸杞子及提取物農藥殘留量 ng·g-1

3.4 膳食風險評估

膳食暴露評估可以判斷食品中各類污染物的風險等級，依據世界衛生組織(WHO)對膳食暴露風險的定義，使用點評估方法作為膳食暴露風險評估方法，即分為急性膳食暴露風險(EXPa)與慢性膳食暴露風險(EXPc)，采用參考文獻[5]方法計算，急性參考劑量(ARfD)%≤100%說明風險可以接受，ARfD%>100%說明風險不可接受[15]；每日允許攝入量(ADI)%≤100%說明風險可以接受，ADI%>100%說明風險不可接受[16]。累計膳食暴露風險值(RQ)≤100%說明風險可以接受，RQ>100%說明風險不可接受。克百威含3-羥基克百威，甲拌磷含甲拌磷砜及亞砜。殺蟲脒、噠螨靈、克螨特無ARfD值，采用ADI值進行EXPa計算，蟲螨畏ADI值采用ARfD值計算(表6)。對隨機購于市面上的不同等級枸杞子及其水提取物農藥殘留檢測后進行風險評估，結果表明，37種農藥殘留中被檢出的13種農藥均處于較低的風險水平，其EXPa與EXPc均小于100%，且RQ均小于100%，枸杞子及其提取物膳食暴露風險處于可接受范圍。對比不同等級枸杞子，有機食品級膳食暴露風險最小，但RQ與食品安全等級未呈現負相關關系，綠色食品級枸杞子及提取物RQ最高。除綠色食品級外，其余3種級別的枸杞子提取物相較于枸杞子，其RQ均有所降低(表7)。

表6 不同農藥膳食風險參考劑量

表7 不同等級枸杞子及其提取物膳食風險評估結果 %

4 討論

4.1 檢測指標的選取

本研究所選37種農藥建立枸杞子水提取物農藥殘留檢測品種，主要是基于枸杞種植過程中農藥的使用種類、枸杞子農藥殘留檢出種類及相關的法律法規等確定的。根據FDA近5年對我國出口美國的枸杞子自動扣留或退回情況，枸杞子所涉及的農藥殘留檢測品種有多菌靈、殺蟲脒、甲氰菊酯。近年來文獻報道枸杞子農藥殘留超標品種，如毒死蜱、久效磷、克百威等，結合《中國藥典》2020年版[14]禁用或限用農藥種類甲胺磷、甲拌磷、內吸磷等液質檢測品種，既滿足農藥殘留檢測研究的科學性，也兼顧方法的經濟性與普適性。

4.2 儀器檢測方法的優化

本研究的儀器檢測方法主要基于《中國藥典》2020年版[14]及枸杞子藥材農藥殘留檢測文獻報道[6，13]，對色譜條件和質譜參數進行優化。色譜方法主要對流動相初始比例和甲酸體積分數進行微調，選取75%初始水相比例、乙腈(含0.1%甲酸)和水(含0.1%甲酸)為流動相，峰形與分離度較好。質譜條件的優化則以特征離子對選取為主，如在對多菌靈、蟲螨畏等的檢測時，枸杞子提取物存在不同于枸杞子藥材的基質效應，因而采用不同于現有標準及方法的離子對作為定量離子對，以達到最佳的檢測靈敏度。同時，由于相同保留時間共流出組分較多，導致一級質譜對母離子的選擇性差，采用時間窗(detection window)分段檢測模式，可以進一步增強檢測的選擇性和靈敏度，其檢測能力可達十億分之一濃度級別。

4.3 前處理方法的確定

中藥或農產品由于基質復雜，對農藥分子在離子源中的電離存在基質抑制效應，使部分農藥的檢測靈敏度降低，難以達到農藥殘留最大限度要求的定量限[17]。為了提高分析效率、降低基質效應，同時減少有毒有害試劑的使用，對樣本前處理方法的改良和優化是必要的。本研究通過采用直接提取法、QuEChERS法、dSPE及2種固相萃取小柱凈化法對樣品前處理進行對比研究，結果表明，dSPE農藥加樣回收率合格率最高、方法簡便快捷。通過減少無水硫酸鎂的用量、加入GCB等方式改變凈化劑的配比和組成，各農藥的加樣回收率達到測定要求。改良后的方法免去了濃縮步驟，經簡單提取、凈化、離心即可，適于推廣使用。

4.4 枸杞子藥材與提取物的農藥殘留量存在差異

不同等級枸杞子及其水提物的農藥殘留量檢測結果存在明顯的差異，水提物中檢出的11種農藥殘留中僅有克百威(含3-羥基克百威)的殘留量相較于枸杞子有所升高，殺蟲脒、甲拌磷亞砜、克螨特在水提物中未被檢出，毒死蜱、多菌靈、甲氰菊酯、噠螨靈、蟲螨畏、甲拌磷砜、三唑醇在提取物中的殘留量均有不同程度的降低。

查詢PubChem數據庫所登記的農藥理化信息，毒死蜱、多菌靈、甲氰菊酯、噠螨靈、克螨特等在水中溶解度極低(20 ℃，水溶解度<10 mg·L-1)，而克百威的溶解度為350 mg·L-1。根據“相似相溶”原則，毒死蜱和多菌靈等很難被水溶出，即不易殘留于水提物中，而克百威易溶于水，意味著其易殘留于水提取物中。本研究結果表明，毒死蜱、多菌靈等農藥在水提取物中均處于極低的殘留水平(<0.01 mg·kg-1)，然而克百威從枸杞子到枸杞子水提取物的轉移率高達91.5%，出現了富集行為，符合其溶解度高的特征。由于克百威屬于高毒農藥，在膳食暴露風險評估中權重很大，占RQ的96.6%。不難理解，這也是風險評估結果中枸杞子水提物的農藥殘留種類少和總量雖低，但RQ反而增加的原因。上述結果表明，枸杞子水提取對不同農藥殘留的溶出及轉移率不同，由于提取后去掉了水不溶雜質，使水溶性大的農藥殘留相對濃度提高，進而影響水提物的安全系數。由于枸杞子等藥食同源物質，主要采用茶飲水煮食用，因此加強對克百威等水溶性大的高毒農藥的禁用、監管及檢測力度是很有必要的。

5 結論

本研究建立了枸杞子水提取物中37種農藥殘留的UFLC-MS/MS檢測方法，該方法簡便、經濟、快速，可用于枸杞子提取物的農藥殘留快速準確測定。枸杞子加工制備為水提取物時，農藥殘留總量呈現降低水平，膳食暴露風險也同步下降，為枸杞子提取物質量標準的研究提供了新的思路與參考。