基于PB-CCD設(shè)計的化香樹果序堿提酸沉提取工藝△

汪蕓蘭，張鵬，胡坤霞，韓立柱，邱金清，趙佩媛，張新博，宋逍，唐志書

陜西中醫(yī)藥大學 藥學院，陜西 咸陽 712046

化香樹果序為胡桃科植物化香樹的果序[1]，別名化香樹球、化香果等。根據(jù)《湖南藥物志》記載，其具有活血行氣、殺蟲止癢、消腫止痛的功效，通常用于治療鼻炎等相關(guān)病癥[2]、內(nèi)傷所致胸腹脹痛、跌打損傷、筋骨疼痛，也可用于治療癰腫、疥癬、濕瘡等[3]。現(xiàn)代藥理研究表明，化香樹果序具有抗炎抑菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[4]。近些年來發(fā)現(xiàn)，化香樹果序中有效成分鞣花酸具有抗炎、抗氧化[5]、調(diào)節(jié)腸道菌群[6]等生物活性，且具有明顯抗癌、抗誘變活性，尤其是對肝癌[7]、肺癌、鼻咽癌[8]、子宮內(nèi)膜癌[9]等有很好的抑制作用，因此有非常好的市場應(yīng)用前景。

本研究以堿提酸沉法提取，考察液料比、提取時間、提取溫度、堿提液pH、酸沉液體積分數(shù)對化香樹果序內(nèi)鞣花酸提取率的影響[10]，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化化香樹果序堿提酸沉提取工藝，得到可靠的提取工藝條件，以期為化香樹果序鞣花酸提取開發(fā)利用提供參考[11]。

1 材料

1.1 儀器

Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀(Thermo Fisher公司)；Vortex-Genie2型旋渦混合器(北京卓信宏業(yè)儀器設(shè)備有限公司)；800型離心機(上海手術(shù)器械10廠)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PHS-25型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；800Y型高速多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)；FA21040N型電子天平(十萬分之一，賽多利斯上海貿(mào)易有限公司)。

1.2 試藥

對照品鞣花酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：111959-201903，純度：98.8%)；氫氧化鈉(分析純，天津北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司)；鹽酸(分析純，江蘇彤晟化學試劑有限公司)；色譜乙腈、色譜甲醇(Fisher公司)；無水乙醇(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)。

化香樹果序(香菊制藥有限責任公司，批號：20190712)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學胡本祥教授鑒定為胡桃科化香樹屬植物化香樹PlatycaryastrobilaceaSieb.et Zucc的干燥果實。

2 方法

2.1 HPLC條件

色譜柱：AcclaimTM120A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，等度洗脫(20∶80)；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：254 nm[12]；進樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取化香樹果序粗粉約5.0 g，置于100 mL錐形瓶中，按PB試驗設(shè)計的方案加入一定量的一定pH的氫氧化鈉溶液，于一定溫度，提取一定時間，濾過，提取一定次數(shù)后合并濾液，以一定體積分數(shù)的鹽酸溶液滴定至pH為1，靜置24 h，抽濾，棄濾液，濾餅層于室溫條件下自然干燥，稱質(zhì)量，備用。精密稱取濾餅層樣品0.1 g，置于10 mL的量瓶中，65%乙醇溶解并稀釋至刻度，0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

取鞣花酸對照品，精密稱取2.0 mg，配以色譜純甲醇70 mL移至100 mL量瓶，超聲5 min，取出，待恢復(fù)至室溫后，加甲醇稀釋至100 mL，搖勻后得質(zhì)量濃度為0.191 1 mg·mL-1的鞣花酸對照品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1專屬性考察 精密量取鞣花酸對照品溶液、65%乙醇、供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。見圖1。

注：A.鞣花酸對照品；B.供試品溶液。圖1 鞣花酸及化香樹果序供試品HPLC圖

2.4.2線性關(guān)系考察 精密稱取鞣花酸對照品2.10 mg，然后配以色譜甲醇4 mL，超聲10 min，振搖15 min，標記為1，取1中鞣花酸對照品溶液1 mL，精密移取至已經(jīng)精密吸取色譜甲醇1 mL的2 mL離心管中，超聲10 min，振搖15 min，標記為2，重復(fù)操作5次。將5次所得溶液過微孔濾膜后進行進樣分析，測定峰面積。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸。

2.4.3精密度考察 精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次。

2.4.4穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液10 μL，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時進樣，記錄色譜圖。

2.4.5重復(fù)性考察 精密稱取同一樣品，重復(fù)操作6次，依法加色譜甲醇制備供試品溶液，測定含量。

2.4.6加樣回收率試驗 取鞣花酸質(zhì)量濃度為1.29 mg·mL-1的樣品，重復(fù)3次。每份為0.1 mL，每份分別精密加入質(zhì)量濃度為0.198 mg·mL-1的鞣花酸對照品溶液0.31、0.62、0.93 mL，制得高、中、低質(zhì)量濃度的溶液共9份，按2.1項下色譜條件進行測定。記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD。

2.5 Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計

根據(jù)提取過程中的影響因素，選擇液料比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、堿提液pH(D)、酸沉液體積分數(shù)(E)，每個因素設(shè)定最低限度和最高限度[13]。PB設(shè)計因素與水平見表1。按照PB設(shè)計，5個因素進行12次試驗，進行化香樹果序提取，采用高效液相色譜法(HPLC)檢測化香樹果序中鞣花酸含量，以鞣花酸峰面積作為響應(yīng)因子，根據(jù)PB試驗結(jié)果確定對提取過程影響較大的3個因素。

表1 化香樹果序堿提酸沉提取PB設(shè)計因素與水平

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學考察結(jié)果

專屬性考察結(jié)果展示的色譜峰分離度良好，峰形尖銳，符合含量測定要求(圖1)；線性關(guān)系考察得到鞣花酸的回歸方程：Y=1 146.5X-11.57(r=0.999 4)，結(jié)果表明，鞣花酸在0.032 16～0.514 50 mg·mL-1與其峰面積線性關(guān)系良好；精密度考察結(jié)果鞣花酸峰面積RSD為1.32%，說明此儀器精密度良好；穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，24 h內(nèi)RSD為1.16%，表明此溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定；重復(fù)性考察所得鞣花酸平均質(zhì)量分數(shù)為0.79 mg·g-1，RSD為0.98%，表明此方法重復(fù)性良好；加樣回收結(jié)果得鞣花酸平均回收率為99.79%，RSD為0.48%(表2)。

表2 化香樹果序堿提酸沉提取鞣花酸加樣回收率考察結(jié)果

3.2 PB試驗

根據(jù)PB試驗方案進行試驗，結(jié)果見表3。

表3 化香樹果序堿提酸沉提取PB試驗設(shè)計及結(jié)果

采用Design-Expert Version 10.0.7統(tǒng)計軟件進行ANOVA方差分析，由分析結(jié)果(表4)可知，液料比、提取溫度、堿提液pH的P值分別為0.022 7、0.047 6、0.015 0，均小于0.05，說明液料比、提取溫度、堿提液pH是影響化香樹果序堿提酸沉法提取鞣花酸的顯著因素。根據(jù)各影響因素對鞣花酸峰面積的ANOVA分析，結(jié)合最大值運算結(jié)果，將影響不顯著的因子進行最大值預(yù)測，結(jié)果提取時間為81.631 2 min，酸沉液體積分數(shù)為9.614 09%，結(jié)合實際情況選擇提取時間為80 min，酸沉液體積分數(shù)為10%。

表4 化香樹果序堿提酸沉提取PB試驗設(shè)計數(shù)據(jù)ANOVA方差分析

3.3 星點設(shè)計(CCD)試驗

在PB結(jié)果的基礎(chǔ)上，以CCD對響應(yīng)因子具有顯著性影響的因素A、C、D進行優(yōu)化，以確定最優(yōu)的參數(shù)設(shè)置，通過HPLC測定鞣花酸含量。

采用Design-Expert Version 10.0.7軟件設(shè)計優(yōu)化試驗，CCD影響因素水平設(shè)計見表5，CCD試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。根據(jù)結(jié)果，繪制此次實驗數(shù)據(jù)的效應(yīng)曲面圖和等高線圖(圖2～4)。在3種因素交互作用的三維圖中，堿提液pH與提取溫度的響應(yīng)面的曲張程度最大，而液料比與提取溫度、液料比與堿提液pH的響應(yīng)面的曲線較平滑，表明堿提液pH與提取溫度間的交互作用強于其他因素間的交互作用[14]。

表5 化香樹果序堿提酸沉提取CCD試驗影響因素與水平

表6 化香樹果序堿提酸沉提取CCD三因素五水平試驗及結(jié)果

圖2 提取溫度與液料比對化香樹果序中鞣花酸含量的交互影響

圖3 堿提液pH與液料比對化香樹果序中鞣花酸含量的交互影響

圖4 提取溫度與堿提液pH對化香樹果序中鞣花酸含量的交互影響

3.4 回歸模型建立與驗證分析

使用Design-Expert Version 10.0.7統(tǒng)計軟件對表6的試驗結(jié)果進行擬合分析，得到自變量A、C、D與因變量鞣花酸含量的二次多項回歸方程為Y=0.52+0.052A+0.13C+0.41D+0.067AC-0.008AD-0.042CD-0.22A2+0.18C2+0.29D2。方差分析結(jié)果見表7。

表7 化香樹果序堿提酸沉提取CCD三因素五水平試驗設(shè)計結(jié)果數(shù)據(jù)ANOVA方差分析

由表7可知，回歸模型極為顯著(P<0.01)，模型的決定系數(shù)R2=0.913 1，說明回歸模型中自變量與因變量的回歸關(guān)系是顯著的，具有統(tǒng)計學意義[15]。失擬項P值為0.221 5>0.05，失擬項不顯著，表明此回歸方程擬合程度良好。各因素對堿提酸沉法提取鞣花酸的影響順序為D>C>A。

3.5 最優(yōu)工藝與驗證實驗

根據(jù)PB-CCD設(shè)計結(jié)果，液料比13.016 7、提取溫度85 ℃、堿提液pH 13，結(jié)合實際生產(chǎn)情況，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為提取時間80 min、酸沉液體積分數(shù)10%、液料比13、提取溫度85 ℃、堿提液pH 13。在此條件下，重復(fù)進行3次提取試驗，鞣花酸質(zhì)量分數(shù)分別為1.47、1.46、1.47 mg·g-1，平均質(zhì)量分數(shù)為1.47 mg·g-1，與理論值1.45 mg·g-1相近，說明本實驗最終得到的堿提酸沉法提取化香樹果序中鞣花酸的提取工藝穩(wěn)定可靠。

4 討論與結(jié)論

響應(yīng)面分析法是一種比較有效的數(shù)學統(tǒng)計方法，采用多元二次回歸方程來擬合各個影響因素與相應(yīng)響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，尋找最優(yōu)的工藝參數(shù)。相比于單因素試驗和正交試驗設(shè)計，試驗次數(shù)少、周期短、模型預(yù)測性良好。本實驗采用PB-CCD設(shè)計，以鞣花酸含量為考察指標，優(yōu)化化香樹果序堿提酸沉提取工藝。通過PB設(shè)計選定5個影響因素：液料比、提取時間、提取溫度、堿提液pH、酸沉液體積分數(shù)進行試驗。預(yù)實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當堿提液pH為8～14時，體積分數(shù)為8%和14%的酸沉液均無法在滴定pH>1獲得堿提酸沉提取物，因此，選擇酸沉pH終點為1。再篩選出的3個顯著影響因素：液料比、提取溫度、堿提液pH繼續(xù)進行優(yōu)化，確定鞣花酸提取的最佳工藝：液料比13、提取時間80 min、提取溫度85 ℃、堿提液pH 13、酸沉液體積分數(shù)10%。實驗結(jié)果為下一步開發(fā)利用化香樹果序及其鞣花酸打下了良好基礎(chǔ)，后期可對化香樹果序堿提酸沉液中的有效成分進行研究。