丹參提取工藝過程中糖類成分變化趨勢△

周立紅，周夢鴿，齊敏超，楊哲萱，劉朋，章順楠*，朱永宏，王濤

1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天士力醫藥集團股份有限公司 中藥先進制造技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300410

丹參是唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根及根莖，具有活血化瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消痛的功效[1]。丹參提取物能夠從心肌缺血的不同階段發揮保護作用[2]，可以降低心肌缺血誘導因子的產生[3]、舒張血管[4]、提高心肌代謝效率[5]、降低心肌細胞凋亡率，達到保護受損心肌的作用[6]。

《藥品生產質量管理規范》(GMP)2010年版明確指出，中藥制劑的質量與中藥提取工藝密切相關，因而，對中藥提取過程建立過程控制標準、提高批次間質量一致性是保證中藥產品質量提升的關鍵點之一。水提液醇沉工藝是中藥提取精制的傳統手段，較高的乙醇體積分數可以去除蛋白質、鞣質、水溶性色素等雜質，還包括大分子的多糖類成分[7]。丹參提取物是丹參藥材經水提醇沉多道工序得來的中成藥原料。已知糖類成分總量占丹參提取物總量的50%左右，經過高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)分析表明，其中糖類成分相對分子質量在2000以下，屬于單糖和低聚糖[5]。糖類成分在整個提取工藝過程中總量占比最高，性質相對穩定，因而對提取工藝過程中糖類成分變化趨勢的研究，有助于加深對提取工藝過程的理解，提高工藝控制水平。

糖類成分的含量檢測方法有苯酚-濃硫酸的比色法、柱前衍生化法、HPLC-示差檢測器法、高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(HPLC-ELSD)等。其中，苯酚-硫酸法專屬性較差，而且只能做總糖測定，不能測定糖類成分組成[8]；柱前衍生化法操作步驟繁瑣[8]；示差折光檢測器的靈敏度低、平衡時間長[9]；HPLC則用時較長[10]。本研究建立了超高效液相色譜-蒸發光散射檢測法(UPLC-ELSD)，采用Waters UPLC-BEH amide色譜柱，有效去除其他物質干擾，在15 min內完成對丹參提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖5種糖的含量測定，該方法更加簡便、快捷。

1 材料

1.1 儀器

Waters超高效液相色譜儀，包括蒸發光檢測器(ELSD)、Empower 3 化學工作站等；XS205型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

標準品果糖(批號：059K00681V，純度：100%)、葡萄糖(批號：059K00681V，純度：99.5%)、蔗糖(批號：090M02112V，純度：99.5%)、棉籽糖(批號：BCBH6893V，純度：99%)、水蘇糖(批號：MKBL6314V，純度：98%)均購于Sigma公司；乙腈(默克公司，色譜純)；三乙胺(Sigma公司，純度：99.5%)；甲醇[利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司，分析純]；水為實驗室自制。

丹參提取物(丹參素質量分數≥3%)由天士力醫藥集團股份有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 檢測方法

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：20 ℃；流動相：乙腈-水(67∶33，含0.2%三乙胺)；流速：0.11 mL·min-1；進樣量：1 μL。蒸發光檢測器增益：200；載氣壓力：241.316 Pa；漂移管溫度：50 ℃；霧化器參數65%。

對照品溶液的制備：取果糖約0.080 g、葡萄糖約0.050 g、蔗糖約0.360 g、棉子糖約0.088 g、水蘇糖約1.000 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻。取5 mL置25 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液3 mL，置10 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品混合溶液1。精密量取上述對照品儲備液7 mL，置10 mL量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品混合溶液2。

供試品溶液的制備：精密稱取丹參提取物約0.4 g，置10 mL量瓶中，加純化水適量，超聲使溶解，放冷，定容至刻度，搖勻，精密量取2 mL上至已處理好的固相萃取小柱[Cleanert PS-SPE，1000 mg·(6 mL)-1，甲醇20 mL，水20 mL活化]，用純化水以0.1 mL·min-1的速度洗滌，收集全部洗脫液至10 mL量瓶，加純化水至刻度，搖勻，即得。

測定法：將供試品溶液和對照品混合溶液1、對照品混合溶液2分別進樣1 μL，見圖1，采用外標兩點法計算供試品中各成分含量。

注：A.對照品；B.供試品；1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.棉子糖；5.水蘇糖。圖1 對照品及丹參提取物糖成分色譜圖

外標兩點法對數方程：Y=KX+b，其中，Y=lgC，X=lgA。

(1)

式中，K為外標兩點法對數方程斜率；A為峰面積；b為外標兩點法對數方程截距；W為稱樣量。

2.2 樣品含量測定

應用所建立的UPLC-ELSD，測定19批不同年份生產規模的丹參提取物糖類成分含量。從表1中數據可以看出，丹參提取物中含量最高的寡糖成分是水蘇糖(四糖)，其次是蔗糖、果糖、葡萄糖和棉子糖，且各個樣品中5種糖類成分含量差異較小。

表1 丹參提取物糖類組分含量測定結果 %

2.3 提取過程中糖類成分轉移率

取3個不同批次的丹參提取工藝過程中間體(提取液、濃縮液、醇沉上清液、稀浸膏)，按照2.1項下方法測定各個樣品的5種糖類成分含量，并通過每個工藝節點總量計算各糖類成分質量分數(表2)，同時計算提取工藝中各工序糖類成分的轉移率(各工序所測糖總量與提取工序獲得相應糖總量百分比)，結果見圖2。

表2 丹參提取工藝過程中間體糖類成分質量分數 %

圖2 糖類成分在提取過程中的轉移率

數據結果分析發現，在提取工藝過程中不同批次的糖類成分的變化趨勢一致，總量均為明顯下降趨勢，而且在醇沉工序下降幅度最大，見圖2。在醇沉工序糖類成分轉移率與相對分子質量關系直觀圖可以看出(圖3)，單糖(果糖、葡萄糖)、二糖(蔗糖)轉移率相當，分別為38.51%、36.41%、34.92%；但隨著相對分子質量的增加，轉移率下降明顯，其中水蘇糖(四糖)的轉移率最低，平均僅為12.06%。

圖3 不同相對分子質量糖成分醇沉工序轉移率

2.4 醇沉方式對糖類成分轉移率影響

由于醇沉工序是影響糖成分的關鍵步驟，因此，醇沉方式也可能影響醇沉效果，從而影響終產品的質量一致性。考察2種醇沉方式對丹參提取物糖成分含量的影響，一種為以表觀醇度判定終點法，即少量逐次加入乙醇；另一種方式為通過計算一次性倍量加入乙醇，兩者乙醇加入總量相當。分別對30批次丹參提取物5種糖含量進行檢測。組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)并以t檢驗。統計結果見表3，兩者總糖含量差異有統計學意義(P<0.001)，平均質量分數分別為39.92%、34.44%；其中，果糖(單糖，P<0.01)和水蘇糖(四糖，P<0.001)2種成分含量差異有統計學意義，以表觀醇度判定終點法為醇沉方式得到的提取物中水蘇糖含量較高，而倍量乙醇加入法果糖含量較高。總體上，倍量乙醇加入法的組內差異RSD較小。2種醇沉方式各批次提取物糖含量分布見圖4。

表3 不同醇沉方式對丹參提取物中糖成分含量影響 %

圖4 不同醇沉方式對多批次丹參提取物糖成分含量分布的影響

3 討論

多個生產批次含量考察結果可以看出，丹參提取物中糖類成分含量波動較小；提取物總量與糖類成分總量進行相關性分析，結果相關性在0.9以上。且5種糖類成分在丹參提取工藝過程中均表現穩定，尤其是水蘇糖含量最高，因此其能夠很好地作為提取工藝過程質量一致性的表征。

在提取工藝過程中間體的糖類成分研究中發現，多批次樣品糖類成分在整個提取工藝過程中變化一致，整體呈下降趨勢，醇沉過程下降最為明顯，表明醇沉工序是影響糖含量的關鍵工序。很多研究已表明，醇沉醇度與糖類成分轉移率相關性最強，與相對分子質量呈反比[11]；即醇沉工藝能夠用以去除大相對分子質量的糖類成分。這對純化中藥有效成分、提高治療效果及揭示藥效物質基礎、確保質量一致性至關重要[12]。本研究中糖成分轉移率與相對分子質量分布情況也驗證了上述趨勢，小相對分子質量的單糖、二糖轉移率相當，三糖、四糖則隨著相對分子質量的增加轉移率趨于降低，且下降明顯，這與糖在介質中溶解度差異有很大的關系[13]。

本研究醇沉方式考察也表明，不同方式影響不同相對分子質量糖成分的轉移率，而水蘇糖相對分子質量最大，含量也最高，顯示了與總糖含量與波動一致性現象。再者，即使加醇量一致，不同的放入方式也會影響總糖與單成分的含量和波動，這與過程中溫度、工序時間及過程中成分在料液中的溶解行為有關，應該綜合考慮工藝參數的設計以提高工藝過程控制能力[14]；糖類成分可以作為醇沉工藝控制能力的表征。