正交試驗-多指標綜合評分法優選小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方湯劑的水提工藝△

李玥，吳文靜，甘璐，成睿珍

天津市濱海新區中醫醫院，天津 300450

腸系膜淋巴結炎為兒科臨床常見病，多發于7歲以下兒童，且男孩發病率高于女孩[1-2]。臨床上主要表現為腹痛，有時可伴有嘔吐、腹瀉、腹脹、便秘、食欲不振等癥狀，部分患兒還可能有白細胞升高、發熱等表現，嚴重影響患兒的身心健康和生長發育[3-4]。然而，現代醫學缺乏行之有效的治療方法，目前多采用控制飲食、靜脈滴注或口服抗生素抗感染、抗病毒、解痙止痛等治療手段[5-6]，雖可緩解眼前腹痛癥狀，但治標不治本，不良反應大，患兒極易產生耐藥性，導致腹痛再次發作，甚至引起其他疾病。

中醫學認為，腸系膜淋巴結炎有寒、熱、虛、實之分，病因多有內外之別。小兒由于臟腑嬌嫩、形氣未充、衛外功能不固、對寒暖不能自調，外易為六淫所侵，內易為飲食所傷，臨床辨證多分為寒凝中焦、乳食積滯、臟腑虛寒、氣滯血瘀等證型，治療上多采用溫中散寒、消食導滯、溫中補虛、理氣化瘀等治則[7-10]。

本研究選用天津市濱海新區中醫醫院兒科常用于治療小兒腸系膜淋巴結炎的中藥貼敷處方。此方結合臨床辨證施治，已在臨床廣泛應用10余年，并取得良好療效。處方主要由吳茱萸、木香、肉桂、丁香和小茴香等9味中藥組成，功效為溫中散寒、緩急止痛，主要用于治療脾胃虛弱，感受寒邪，寒凝氣滯導致的腹痛、腹瀉、嘔吐、厭食等癥。辯證要點為食欲差、腹痛、腹脹，遇冷則重，得溫則減，嘔吐食物或清水，或大便溏，苔白或白膩。

方中吳茱萸味辛，性熱，歸肝、胃經，散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉；木香味辛、苦，性溫，歸脾、胃、大腸、三焦經，辛行氣滯、苦消氣結、行氣止痛、健脾消食；丁香具有溫中降逆、散寒止痛、溫腎助陽之效；小茴香味辛，性溫，歸脾胃肝經，理氣和胃、開胃健脾；延胡索味辛苦，性溫，活血祛瘀、行氣止痛。諸藥合用，理氣濕中、散寒止痛，共奏溫中芳香、利濕止痛之功，配合口服中藥湯劑及西醫抗生素抗炎等治療方法，能夠有效地治療小兒腸系膜淋巴結炎[11]。

1 材料

1.1 儀器

LC20A型高效液相色譜系統[LC-20AD泵、SIL-20AC型自動進樣器、SPD-M20A型二極管陣列檢測器、CTO-20A型柱溫箱、CBM20Alite型控制器、DGU-20A3R(C)型脫氣機、LabSolutions色譜工作站，日本島津公司]；AL-204型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；KQ-300DE型臺式數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯和去氫木香烴內酯(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為DC-18031410、DC-18031411、DC-17101310、DC-17101311，純度≥98%)；對照品桂皮醛和丁香酚(北京北納創聯生物技術研究院，批號分別為BWB52030、BWB50285，純度≥98%)；超純水為自制；甲醇為色譜純。

小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方包括吳茱萸、木香、丁香、肉桂、小茴香等9味中藥飲片，由天津市濱海新區中醫醫院藥學科提供，經劉海副主任中藥師鑒定，均符合《中華人民共和國藥典》2015年版中規定。

2 方法與結果

2.1 中藥復方水提液的制備

小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方由吳茱萸20 g、木香20 g、丁香10 g、肉桂10 g、蒼術20 g、小茴香20 g、車前子10 g、延胡索20 g和白胡椒30粒組成。

稱取以上9味中藥飲片，粉碎為粗粉后置于圓底燒瓶中，隨后分別加入適量的蒸餾水，浸泡30 min后，開啟電熱套進行回流提取，趁熱濾過，濃縮至適量，放冷至室溫，加水定容至500 mL，混勻，備用。

2.2 指標成分的含量測定

2.2.1供試品溶液的制備 分別精密移取以上水提液1 mL，用無水甲醇稀釋2倍，混勻，醇沉，濾過，取續濾液，備用。

2.2.2色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；甲醇(A)-水(B)為流動相，梯度洗脫(0～7 min，39%A；7～15 min，39%～58%A；15～38 min，58%A；38～40 min，58%～79%A；40～52 min，79%A；52～52.5 min，79%～39%A；52.5～65 min，39%A)；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長為200～400 nm；進樣量為10 μL。色譜圖見圖1。

注：A.空白溶液；B.混合對照品溶液；C.供試品溶液；1.吳茱萸堿；2.木香烴內脂；3.去氫木香烴內脂；4.桂皮醛；5.丁香酚；6.吳茱萸次堿。圖1 空白溶液、混合對照品及小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方湯劑供試品溶液的HPLC圖

2.2.3對照品溶液的制備 分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中，用70%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻。得質量濃度分別為38.70、19.40、61.36、74.00、70.20、677.56 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.2.4陰性供試品溶液的制備 稱取含指標成分以外的其他藥味，按2.1和2.2.1項下方法制備陰性供試品。

2.2.5線性關系考察 精密移取上述混合對照品儲備液，用70%甲醇逐級稀釋，制成一系列不同質量濃度的對照品溶液。按2.2.2項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖和峰面積。分別以各指標成分的峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行線性回歸分析，得線性回歸方程分別為吳茱萸堿Y=29 997.55X+9 984.91(r=1.000 0)、吳茱萸次堿Y=71 925X+170 22(r=0.999 6)、木香烴內酯Y=24 169.895X+21 941.38(r=0.999 6)、去氫木香烴內酯Y=13 531.06X+11 520.07(r=0.999 6)、桂皮醛Y=36 052X+34 794(r=0.999 6)和丁香酚Y=2 910 800X+120 550(r=0.999 6)，其線性范圍分別為0.604 7～38.700 0、0.001 1～19.400 0、0.003 7～61.360 0、0.004 6～74.000 0、0.004 4～70.200 0、0.040 0～677.560 0 μg·mL-1。以上結果表明，各成分在各自的質量濃度范圍內線性關系良好。

2.2.6精密度試驗 精密吸取高、中、低3種不同質量濃度的混合對照品溶液，按2.2.2項下色譜條件進樣分析，連續進樣6次，測定6種成分的峰面積，計算各成分的含量，求日內、日間精密度。吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚的日內精密度RSD分別為 0.72%、1.14%、1.20%、1.81%、1.06%和1.00%。日間精密度的RSD分別為 1.73%、2.60%、2.07%、2.90%、2.04%和1.97%。結果表明，儀器的日間、日內精密度良好。

2.2.7重復性試驗 取處方按2.1項下方法制備水提液，按2.2.1項下方法制備供試液共6份，按2.2.2項下色譜條件進樣分析，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚6種成分的峰面積，計算各成分含量的RSD分別為1.19%、2.14%、1.29%、2.69%、1.70%和1.26%。結果表明，此法重復性良好。

2.2.8穩定性試驗 取處方按2.1項下方法制備水提液，按2.2.1項下方法制備供試品溶液1份，按2.2.2項下色譜條件分別于0、4、8、12、16、20、24 h進樣分析，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚6種成分的峰面積，計算各成分含量的RSD分別為0.20%、0.29%、1.06%、0.63%、1.12%和0.92%。結果表明，供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.2.9加樣回收率試驗 精密量取已知6種指標成分含量的供試液6份，分別加入等量的對照品，按2.2.2項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。測得吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分別為100.33%、98.90%、100.70%、99.44%、99.42%和102.75%，其加樣回收率的RSD分別為2.05%、1.74%、3.00%、2.85%、1.94%和2.83%，見表1。

表1 小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方湯劑中6個成分加樣回收率結果

2.3 水提工藝的優選

2.3.1單因素考察

2.3.1.1提取溶劑用量的考察 按處方量稱取各味藥，分別加入4、6、8、10和12倍量水回流提取1次，每次1 h，平行3份。按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件進樣分析，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚的峰面積，計算各成分的相對含量。根據各指標含量的變化，正交試驗設計選擇加水量為8、10和12倍量(圖2)。

圖2 單因素考察加水量對各指標成分提取量的影響

2.3.1.2提取時間的考察 按處方量稱取各味藥，加入6倍量水，分別回流提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取1次，平行3份。按2.2.1項下方法制備供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件進樣分析，測定吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚的峰面積，計算各成分的相對含量(圖3)。根據各指標含量的變化，正交試驗設計選擇提取時間為1.5、2.0、2.5 h。

圖3 單因素考察提取時間對各指標成分提取量的影響

2.3.2多指標成分權重系數的確定 對處方中君臣佐使及其指標成分的含量進行分析，將吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚6種成分的權重系數分別設定為0.25、0.25、0.15、0.15、0.10和0.10。

2.3.3正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，又將提取次數作為其中的考察指標。采用正交設計ⅡⅤ3.1篩選最佳工藝，選擇三因素三水平，按L9(34)正交設計進行試驗(表2)。以吳茱萸堿等6種成分為測定指標，采用加權綜合評分法，對實驗結果進行統計，以指標成分含量的綜合評分值對實驗結果進行直觀分析(表3)和方差分析(表4)，確定最佳提取工藝。

表2 小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方湯劑正交試驗因素設計

表3 小兒腸系膜淋巴結炎中藥復方湯劑中6種指標成分的正交試驗結果

表4 中藥復方湯劑中6種指標成分的綜合評分方差分析

2.3.4多指標綜合評分分析 由表3的R值直觀分析和表4方差分析可知，各考察因素對考察指標影響大小的次序為C>A>B，其中C影響差異有統計學意義(P<0.05)，A和B在實驗所設范圍內無差異。綜合正交設計結果、時間和成本問題，得出最佳試驗方案為A1B1C3，即8倍量水，提取1.5 h，提取3次。

2.3.5驗證實驗 為了進一步驗證所選最優工藝，按照優選的水提工藝進行3組驗證實驗。由結果可知，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、桂皮醛和丁香酚的相對質量分數分別為702.25、101.88、102.79、376.17、210.69、1.38 mg·g-1，RSD分別為1.97%、2.11%、2.06%、2.15%、1.67%和1.61%。結果表明，該工藝穩定、可行。

3 討論

3.1 考察指標及權重系數的確定

本研究通過對主要藥味的有效成分進行含量測定，根據復方中不同藥味的地位分配權重，進行多指標成分權重分析。方中吳茱萸為君藥，其中吳茱萸堿和吳茱萸次堿是其發揮助陽、散寒止痛功效的物質基礎。研究表明，其可對醋酸引起小鼠扭體反應有鎮痛效果[12]，故將吳茱萸堿和吳茱萸次堿的權重系數均定為0.25。臣藥木香辛行氣滯、苦消氣結，其中具有抗炎、止痛的有效成分為萜類木香烴內酯和去氫木香烴內酯，能夠抑制一氧化氮(NO)的產生和核轉錄因子(NF)-κB的活化[13-15]，故將木香烴內酯和去氫木香烴內酯權重系數均定為0.15。肉桂和丁香均為辛香之品，為佐藥，其揮發性成分桂皮醛和丁香酚能夠溫中散寒、止痛，具有良好的體外抗菌、抗炎作用，不良反應小，將其權重系數均定為0.1。因此，本研究綜合相關文獻的報道，選擇以上各指標作為考察對象，理論上對小兒腸系膜淋巴結炎起到很好的治療作用。

3.2 色譜條件的優化

根據各指標成分的理化性質，即吳茱萸堿和吳茱萸次堿為生物堿類，木香烴內酯和去氫木香烴為內酯萜類，而桂皮醛和丁香酚為極性較小的揮發性成分，結合文獻報道的各成分HPLC含量測定的方法[16-18]，本研究采取梯度洗脫的方法，于不同吸收波長采集色譜數據，測定各成分的相對含量。經方法學考察發現，該方法科學合理、可行穩定，適于此復方中6種指標成分的含量測定。

3.3 提取工藝的優選

中藥復方在傳統的水回流提取工藝研究過程中，提取時間、提取次數和加水量等因素對實驗結果的影響十分重要。為了全面反映該湯劑對小兒腸系膜淋巴結炎的作用效果，并將其有效成分充分提取出來，筆者通過前期的文獻調研，結合單因素考察的結果，確定正交試驗設計的因素水平，通過對主要藥味的有效成分進行含量測定，根據復方中不同藥味的地位分配權重，進行多指標成分權重綜合評分分析。本研究綜合正交設計結果、時間和成本問題，得出該湯劑的最佳提取工藝為8倍量水，提取3次，每次1.5 h。

此外，本研究在小兒腸系膜炎中藥復方湯劑的提取工藝實驗研究中，充分考慮方中君、臣、佐、使的配伍原則及其有效成分的藥理特性[19]，運用單因素分析結合正交試驗-多指標綜合評分的方法，確定該湯劑的提取工藝并進行了驗證。該研究具有一定的科學性，可為后續制劑工藝的篩選、評價新藥的研發提供參考。