UPLC-PDA同時測定肝復康丸中10個成分含量及主成分分析

王會品，王金梅

1.鄭州市第三人民醫院，河南 鄭州 450000；2.河南大學 藥學院，河南 鄭州 475000

肝復康丸是由五味子、太子參、白花蛇舌草3味中藥按2∶1∶1的處方比例制備而成的水蜜丸，收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第7冊，具有收斂、益氣、解毒、降谷丙轉氨酶的功效，用于急慢性肝炎、早期肝硬化和肝功能不良等癥[1]。五味子具有收斂固澀、生津止渴、補腎寧心的功效，臨床用于治療久咳虛喘、夢遺滑精、自汗盜汗、內熱消渴、心悸失眠等癥。現代天然藥物化學、藥理學研究證明，木脂素類成分是五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化、抗腫瘤等作用[2]；太子參具有益氣健脾、生津潤肺的功效，其指標成分太子參環肽B具有抑制酪氨酸酶和黑色素產生的作用[3]；白花蛇舌草為臨床常用治療惡性腫瘤和各種炎癥的中藥，其黃酮類化學成分具有抗腫瘤、抗化學誘變的藥理活性[4]。《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成分制劑》第7冊采用化學鑒別法定性分析肝復康丸，缺少定量分析指標，文獻報道僅限于采用高效液相色譜法(HPLC)測定肝復康丸中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素等成分的含量，指標成分單一、分析時間長[5-7]。超高效液相色譜法(UPLC)的快速發展為中藥及中成藥的分離分析提供了良好平臺。本研究選擇五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚、熊果酸及太子參環肽B作為指標成分，利用超高效液相色譜儀同時進行含量測定，為提高肝復康丸質量控制水平及深入臨床研究提供參考。

1 材料

H-Class型超高效液相色譜儀(包括QSM二元溶劑管理器、二極管陣列檢測器、SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱、Empower 3色譜工作站，Waters公司)；ABS-135S型電子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；KQ500D型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司，功率：280 W，頻率：40 kHz)。

對照品蘆丁(批號：100080-201610，純度：92.6%)、齊墩果酸(批號：110709-201607，純度：91.7%)、槲皮素(批號：100081-201509，純度：98.6%)、山柰酚(批號：110861-201611，純度：95.5%)、熊果酸(批號：110742-201622，純度：94.7%)、五味子醇甲(批號：110857-201714，純度：99.9%)、五味子酯甲(批號：111529-201505，純度：95.3%)、五味子甲素(批號：110764-201513，純度：99.5%)、五味子乙素(批號：110765-201512，純度：99.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品太子參環肽B(批號：20170511，純度：99.0%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純(默克公司)；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

經河南大學藥學院王金梅教授鑒定五味子(批號：20180918，產地：遼寧)為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Ball.的果實；太子參(批號：20170724，產地：山東)為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的塊根；白花蛇舌草(批號：20181107，產地：河南)為茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd.) Roxb.的帶根全草。

肝復康丸(規格：每10粒質量1 g)購自藥店，共收集3個廠家13批的樣品，S1～S4為A公司生產(批號分別為20180704、20180925、20181119、20181206)，S5～S7為B公司生產(批號分別為20180525、20180712、20181223)，S8～S13為C公司生產(批號分別為201712381、201801125、201804271、201805169、201809332、201911274)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Ecilipse C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流動相：乙腈(A)-0.05% 磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2.7 min，3%A；2.7～6.0 min，3.0%～20.5%A；6.0～16.9 min，20.5%～64.0%A；16.9～18.0 min，64.0%A；18.0～23.0 min，64.0%～3.0%A)；流速：0.3 mL·min-1；檢測波長：360 nm(0～3 min，蘆丁；9～10 min，槲皮素；11～12 min，山柰酚)、210 nm(3～9 min，齊墩果酸；12～23 min，熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)、203 nm(10～11 min，太子參環肽B)；柱溫：30 ℃；進樣量：3 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、五味子甲素、五味子乙素適量，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻；精密稱取對照品熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻。分別精密量取上述2種混合對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用60%乙醇定容，搖勻，即配制成含蘆丁57.1 μg·mL-1、齊墩果酸79.3 μg·mL-1、槲皮素48.7 μg·mL-1、太子參環肽B 32.4 μg·mL-1、山柰酚43.6 μg·mL-1、熊果酸137.9 μg·mL-1、五味子醇甲188.3 μg·mL-1、五味子酯甲112.7 μg·mL-1、五味子甲素48.2 μg·mL-1、五味子乙素39.6 μg·mL-1的混合對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取肝復康丸20丸，粉碎，稱取細粉約1.0 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入60%乙醇50 mL，稱定質量，室溫超聲處理(250 W，40 kHz)45 min，取出，放冷至室溫，用60%乙醇補足損失質量，搖勻，15 200 r·min-1(離心半徑為10 cm)離心5 min，取上清液經0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3陰性對照品溶液的制備 取五味子、太子參、白花蛇舌草，按肝復康丸處方比例制備缺五味子陰性對照品、缺太子參陰性對照品、缺白花蛇舌草陰性對照品，按2.2.2項下方法處理，即得相應的陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下的供試品溶液、混合對照品溶液和陰性供試品溶液各3 μL，按2.1項下色譜條件分別進樣，得相應色譜圖(圖1)。結果對比對照品溶液色譜圖，供試品溶液色譜圖中10個有效成分在相應保留時間均有色譜峰，缺五味子陰性對照品色譜圖在五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素保留時間處有相應色譜峰，缺太子參陰性對照品色譜圖在太子參環肽B保留時間處無相應色譜峰，缺白花蛇舌草陰性對照品色譜圖在蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚、熊果酸保留時間處無相應色譜峰。供試品溶液色譜圖中各色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度>1.5，理論板數按五味子醇甲計>12 000，拖尾因子均小于1.05，說明該色譜系統專屬性較好。

注：A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺白花蛇舌草陰性對照溶液；D.缺太子參陰性對照溶液；E.缺五味子陰性對照溶液；1.蘆丁；2.齊墩果酸；3.槲皮素；4.太子參環肽B；5.山柰酚；6.熊果酸；7.五味子醇甲；8.五味子酯甲；9.五味子甲素；10.五味子乙素。圖1 肝復康丸UPLC圖

2.3.2線性關系考察 分別精密吸取2.2.1項下混合對照品溶液0.16、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，分別置于2 mL量瓶中，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件分別進樣3 μL，記錄色譜圖。以各成分的質量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸，計算相應回歸方程和相關系數，見表1。結果表明，各成分均有良好的線性關系。

表1 肝復康丸10個有效成分的回歸方程及線性范圍

取2.2.1項下混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，取各成分峰面積信噪比(S/N)為10時的混合對照品溶液質量濃度為定量限(LOQ)，結果蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素LOQ分別為0.09、0.04、0.15、0.11、0.17、0.28、0.19、0.07、0.04、0.07 μg·mL-1。

2.3.3精密度試驗 取混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，連續進樣6次。結果蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積RSD分別為0.66%、0.57%、0.81%、0.32%、0.48%、0.39%、0.71%、0.69%、0.53%、0.40%，均符合儀器精密度要求。

2.3.4穩定性試驗 取供試品溶液(批號：20180704)，分別于制備后0、4、8、16、20、24 h按2.1項下色譜條件進樣3 μL。結果蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為2.41%、1.85%、1.26%、2.25%、2.07%、1.63%、1.90%、1.14%、2.13%、1.57%，表明供試品溶液24 h內穩定。

2.3.5重復性試驗 取供試品細粉(批號：20180704)6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣3 μL測定。結果樣品中蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素平均質量分數分別為1.142、1.586、0.973、0.647、0.871、2.758、3.765、2.254、0.963、0.791 mg·g-1，RSD分別為0.51%、0.92%、0.47%、0.38%、1.74%、0.95%、0.69%、1.22%、0.43%、1.56%，表明該方法重復性良好。

2.3.6加樣回收率試驗 取已知含量供試品(批號：20180704)細粉9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別置于100 mL錐形瓶中，分成3組，分別精密加入含蘆丁(0.229 mg·g-1)、齊墩果酸(0.318 mg·g-1)、槲皮素(0.195 mg·g-1)、太子參環肽B(0.130 mg·g-1)、山柰酚(0.175 mg·g-1)、熊果酸(0.553 mg·g-1)、五味子醇甲(0.755 mg·g-1)、五味子酯甲(0.452 mg·g-1)、五味子甲素(0.193 mg·g-1)、五味子乙素(0.159 mg·g-1)的混合對照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2項下方法處理，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，記錄色譜圖，計算各成分的平均加樣回收率及其RSD，結果見表2。

表2 肝復康丸加樣回收率試驗結果

續表2

2.4 樣品含量測定

取13批肝復康丸供試品，分別按2.2.2項下條件制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣3 μL，記錄色譜圖及峰面積，按外標法計算蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量，每份樣品重復測定3次，計算平均值，結果見表3。

表3 肝復康丸各成分含量測定結果(n=3) mg·g-1

2.5 聚類分析

利用SPSS 22.0軟件[8-10]，以13批肝復康丸中10個有效成分含量為數據樣本，采用組間均聯法，以Euclidean距離平方為測度，進行系統聚類分析，結果見圖2。根據聚類分析樹狀圖，13批樣品分成3大類：S1～S4為Ⅰ類，S5～S7為Ⅱ類，S8～S13為Ⅲ類。

圖2 13批肝復康丸聚類分析

2.6 主成分分析

以13批肝復康丸中的10個成分含量為指標建立數據集，輸入SPSS 22.0軟件[11-15]，運用因子分析中的主成分分析處理，以特征值>1為提取主成分標準，共提取到A1和A22個主成分，累積方差貢獻率達97.189%>85%，說明A1和A22個主成分可解釋肝復康丸10個有效成分含量的97.189%，具有代表性。其中A1特征值為8.669，方差貢獻率為86.693%，A2特征值為1.050，方差貢獻率為10.496%。2個主成分的相關系數矩陣及因子得分矩陣見表4～5。由表4可知，蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、山柰酚和熊果酸之間均具有較大的正相關性，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素之間均具有較大的正相關性。由表5因子得分矩陣可知，蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均對主成分A1的信息貢獻較大。

表4 肝復康丸主成分分析10個成分相關系數矩陣

表5 肝復康丸主成分分析因子得分矩陣

以每個主成分的特征值占累加特征值的百分比作為權重系數進行線性組合，可得到綜合得分。綜合得分越高，說明以10個有效成分為指標的肝復康丸質量越好。由表6可知，C廠家產品質量較好。

表6 13批肝復康丸主成分得分、綜合得分及排序

F=0.892F1+0.108F2

(1)

F代表綜合得分，F1和F2分別代表2個主成得分，其中Fn=FACn×相應特征值的算術平方根(n代表主成分，FAC為主成分的因子得分系數)。

3 討論

3.1 提取方法考察

本實驗考察了超聲、加熱回流2種不同提取方法，結果無明顯差異，故選擇易于操作的超聲提取法；考察乙醇、80%乙醇、60%乙醇和40%乙醇4種不同提取溶劑及30、45、60 min 3種不同提取時間，結果60%乙醇超聲45 min時10個成分提取率較高，雜質影響較小，故以60%乙醇超聲45 min為最終提取條件。

3.2 流動相的考察

本實驗流動相考察了甲醇、乙腈作為有機相，0.05%甲酸、0.05%磷酸、0.1%磷酸作為水相，結果顯示，乙腈為有機相時，在203 nm波段區基線較平穩，信號干擾小；以0.05%磷酸和0.1%磷酸作為水相時，各主要成分分離效果較好，但0.1%磷酸pH低于色譜柱的使用范圍，故以乙腈-0.05%磷酸作為肝復康丸中10個成分的流動相系統，基線平穩，10個成分分離完全，保留時間適中，峰形較好，專屬性強。

3.3 檢驗波長考察

本實驗采用二極管陣列檢測器，從190～400 nm波長全掃描，結果蘆丁、槲皮素、山柰酚在350～360 nm波長段有最大吸收，齊墩果酸、熊果酸在210 nm處有最大吸收，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在210～245 nm波長段有最大吸收，太子參環肽B在203 nm處有最大吸收，為提高測定的專屬性、準確度和靈敏度，本實驗選擇360 nm(0～3 min，蘆丁；9～10 min，槲皮素；11～12 min，山柰酚)、210 nm(3～9 min，齊墩果酸；12～23 min，熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)、203 nm(10～11 min，太子參環肽B)的波長切換法測定肝復康丸中10個成分的含量。

3.4 液相色譜儀的考察

本實驗分別考察HPLC和UPLC分析，結果UPLC相較HPLC不僅大大縮短了分析時間(由84 min縮短到23 min)，而且溶劑用量更少，降低了分析成本，各主要成分的分離效果更好，靈敏度和專屬性更強，且測定結果準確、可靠，可用于肝復康丸的質量控制。

目前，關于肝復康丸中有效成分的含量測定文獻資料較少，本研究建立了UPLC同時測量肝復康丸中的蘆丁、齊墩果酸、槲皮素、太子參環肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素10個成分的含量，經精密度、穩定性、重復性、加樣回收率等方法學驗證準確有效，可為肝復康丸藥品質量評價提供參考。