轉移性結直腸癌中醫治療優勢人群的腸道菌群及TB淋巴細胞亞群特征分析

閆蘊孜 孫凌云 徐鈺瑩 陳冬梅 閆韶花 楊宇飛

摘要 目的：分析轉移性結直腸癌（mCRC）中醫治療優勢人群腸道菌群及TB淋巴細胞亞群分布特征及相關性。方法：選取2018年3月至2019年3月期間中國中醫科學院西苑醫院腫瘤科門診或病房收治的mCRC患者40例作為研究對象，采用隨機雙盲、安慰劑對照臨床研究方法，隨機分為觀察組與安慰劑組，治療給予常規中醫治療加用祛邪膠囊，對照組在與觀察組相同治療基礎上服用安慰劑膠囊。收集基線時患者的糞便樣本及外周血樣本并進行檢測。根據入組患者3年隨訪的生存結局以及mCRC中醫治療優勢人群判定標準，將患者分為中醫治療優勢人群及非優勢人群，分析2組間腸道菌群及TB淋巴細胞亞群的差異性及相關性。結果：腸道菌群Alpha多樣性分析顯示，中醫治療非優勢人群相比優勢人群具有更高的sobs指數且差異有統計學意義（115.17±19.25 vs.81.96±36.79，P=0.005），中醫治療優勢人群具有更高比例的擬桿菌屬（30.6% vs.23.9%，P=0.33）和普雷沃氏菌屬（5.7% vs.3.9%，P=0.69）;TB淋巴細胞亞群分析結果發現，中醫治療優勢人群組較非優勢人群組具有更高的雙陰T細胞絕對值（89.6±82.0 vs.37.1±16.5，P=0.01）以及非HLA依賴細胞毒性T細胞（83.0±43.6 vs.28.4±18.3，P=0.01）;HLA依賴細胞毒性T細胞絕對值與糞厭氧棒狀菌（Anaerostipes）呈顯著負相關（P=0.04）。結論：mCRC中醫治療優勢人群與非優勢人群在腸道菌群分布以及TB淋巴細胞亞群特征方面存在顯著差異且具有一定相關性，為進一步闡釋中醫優勢人群特征及療效機制提供了必要的科學依據。

關鍵詞 轉移性結直腸癌;中醫藥;優勢人群;腸道菌群;淋巴細胞亞群

Abstract Objective：To analyze the distribution characteristics and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subpopulations in Chinese medicine beneficiaries of metastatic colorectal cancer（mCRC）. Methods：From March 2018 to March 2019， a total of 40 patients with mCRC admitted to the Oncology Department or Ward of Xiyuan Hospital of the Chinese Academy of Chinese Medical Sciences were selected as the research objects. A randomized double-blind， placebo-controlled clinical research method was used and the patients were randomly divided into a treatment groups and a placebo group. The treatment group was given conventional Chinese medicine treatment plus Quxie Capsules， and the control group was given placebo capsules on the basis of the same treatment as the treatment group. Stool samples and peripheral blood samples of patients at baseline were collected and tested. According to the survival outcome of the three-year follow-up of the enrolled patients and the criteria for determining the dominant group of Chinese medicine treatment of mCRC， the patients were divided into a dominant group and a non-dominant group of traditional Chinese medicine treatment. The difference and correlation of intestinal flora and TB lymphocyte subgroups between the 2 groups were analyzed.Results：The Alpha diversity analysis of the intestinal flora showed that the Chinese medicine in the treatment of non-beneficiaries populations had a higher SOBS index than the Chinese medicine beneficiaries populations group and there was a significant statistical difference （115.17±19.25 vs. 81.96±36.79， P=0.005）. Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher proportion of Bacteroides （30.6% vs. 23.9%， P=0.33） and Prevotella （5.7% vs.3.9%， P=0.69）; the analysis of TB lymphocyte subsets found that the Chinese medicine beneficiaries populations group had a higher absolute value of double-negative T cells （89.6±82.0 vs. 37.1±16.5， P=0.01） and non-HLA dependent group than the other group （83.0±43.6 vs.28.4±18.3），P=0.01）; the absolute value of HLA-dependent cytotoxic T cells was significantly negatively correlated with Anaerostipes （P=0.04）. Conclusion：there are significant differences in the distribution of intestinal flora and the characteristics of TB lymphocyte subgroups between the dominant and non-advantaged groups of Chinese medicine treatment of mCRC， which provide a necessary scientific basis for further explaining the characteristics of the dominant group of traditional Chinese medicine and the mechanism of efficacy.

Keywords Metastatic colorectal cancer; Traditional Chinese medicine; Dominant population; Intestinal flora; Lymphocyte subsets

中圖分類號：R273文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.008

2021年國家癌癥中心最新數據顯示，2015年結直腸癌發病率為17.81%，居全部惡性腫瘤發病率第4位，結直腸癌死亡率為8.12%，居全部惡性腫瘤死亡率第5位，且發病率及死亡率呈上升趨勢[1]。近十年來隨著靶向治療及免疫治療的進展，轉移性結直腸癌（Metastatic Colorectal Cancer，mCRC）患者的總生存期不斷被延長，目前臨床研究顯示mCRC中位生存期可達3年[2]。盡管目前循證醫學證據表明以化放療、靶向及免疫治療為基礎的腫瘤規范化治療能夠為mCRC帶來最大的臨床獲益，但上述現代醫學治療方法在帶來療效的同時，也增加了產生不良反應的風險，降低患者總體生命質量，帶來個人及家庭經濟負擔，從而影響患者對治療的依從性及耐受性。真實世界數據表明，RAS突變、右半結腸、高齡、體質差、經濟狀況差和治療意愿不強的患者較難從西醫規范治療中獲益，且這部分人群所占比例高達40%以上[3]。因此，臨床試驗及指南推薦與實際臨床中所面臨問題之間的差異是目前我國mCRC綜合治療領域中亟待正視與解決的困境之一。

近年來多項研究表明中西醫結合治療在延長mCRC患者生存期的同時也能夠改善其生命質量，因此我國所特有的中西并重方案有望能夠幫助更多患者得到獲益[4-5]。在這一過程中，積極探索中醫治療mCRC的優勢人群并闡釋其特征及療效機制，才能夠與現有臨床指南及規范化治療方案優勢互補，從而形成精準、個體化的診療策略。本團隊經過10余年來的不懈努力，通過前期隨機對照試驗（Randomized Controlled Trial，RCT）及隊列研究初步明確mCRC中醫治療優勢人群特征為：女性、KRAS基因突變、右半結腸以及高齡患者[6]。此外，本團隊對基于真實世界注冊研究基礎上的120例mCRC患者進行長期隨訪，通過病例對照研究方法對其中具有明確基因分型的68例患者進行分析發現，中醫優勢人群與非優勢人群在KPS、是否有黏液血便史、是否接受靶向治療以及口服中藥湯藥時間長短方面差異有統計學意義[7]。通過上述研究我們得出結論，認為mCRC中醫治療優勢人群特征與那些難以從西醫規范化診療獲益的人群具有一定重合性。這進一步說明在mCRC的中西并重診療體系中，中醫藥能夠對更多的mCRC患者起到“雪中送炭”的寶貴作用。

在進一步探討中醫治療mCRC優勢人群的療效機制過程中，腸道菌群與宿主免疫調節的平衡是本團隊較為關注的研究方向[8]。現已有大量臨床及實驗研究證實結直腸癌發生發展與某些細菌菌株和腸道菌群失調有關[9]，如糞腸球菌、志賀菌、脆弱擬桿菌、核梭桿菌等能夠產生毒素和超氧化物，增加宿主炎癥反應、誘導癌癥發生[10]。相反地，另一些細菌也具有保護作用，如雙歧桿菌、乳酸菌、脆弱類桿菌等[11-12]，研究證明這些有益菌保護結直腸癌的機制是通過與病原菌的競爭、代謝和遺傳調節等功能實現的[13]。而中藥在人體內的吸收、代謝同樣有賴于腸道菌群的作用，因此結直腸癌、中藥、腸道菌群3者之間存在一定必然的聯系[14]。前期研究顯示，以祛邪膠囊為代表的中藥復方能夠通過FOXP3家族調控機體T輔助細胞，從而發揮抗腫瘤作用，其與腸道菌群間的相互關系有待進一步明確[15]。基于上述研究及理論基礎，我團隊依托2015年度國家自然科學基金面上項目，通過小樣本中藥干預RCT研究以及3年生存結局隨訪，希望從腸道菌群分布及宿主免疫特征角度分析mCRC中醫治療優勢人群特征，為進一步闡釋中醫治療mCRC的療效機制以及優勢人群的客觀判別標準提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月至2019年3月期間在中國中醫科學院西苑醫院腫瘤科門診或住院診治的Ⅳ期結直腸癌患者40例作為研究對象。

1.2 診斷標準

參照中華人民共和國衛生部醫政司《中國常見惡性腫瘤診治規范》晚期結直腸癌診斷標準。臨床分期采用國際公認的TNM分期[美國癌癥聯合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第八版]。

1.3 納入標準 1）經病理學診斷明確的結直腸癌患者;2）經影像學或病理明確TNM分期診斷為Ⅳ期，且無法對轉移病灶進行手術切除;3）年齡18～80歲，性別不限;4）已結束化療、盆腔放療、靶向治療、免疫治療至少1個月及以上;5）預計生存期大于半年;6）簽署知情同意書，并且依從性好的患者。

1.4 排除標準 1）既往或合并其他原發惡性腫瘤病史;2）合并嚴重心血管系統并發癥、嚴重肝腎功能異常;3）已出現腸梗阻不能口服藥物治療，需要靜脈內高能營養;4）患有嚴重吸收不良或其他影響胃腸道吸收的疾病;5）在入組治療開始前特定期間內接受下列任何治療的受試者：a.在2周內曾接受抗生素口服或靜脈輸液治療;b.正在接受腸道菌群調節劑（如培菲康、乳酸菌素片等）治療。

1.5 研究方法

臨床部分采取隨機雙盲安慰劑對照臨床試驗研究方法。臨床研究方案于2016年6月通過了中國中醫科學院西苑醫院醫學倫理委員會第一次倫理審查（倫理審批號：2016XLA122-1）。2018年3月8日提交倫理修正（修正臨床研究方案版本號1.4，版本日期2018-03-01，修正知情同意書版本號1.4，版本日期2018-03-11，修正案會議倫理審批號：2016XLA122-4）。本研究最終方案已在中國臨床試驗注冊中心完成注冊（注冊號：ChiCTR2000029599）。

觀察組采用常規治療加用祛邪膠囊，該藥是由中國中醫科學院西苑醫院制劑科加工生產，每次0.05 g/kg體質量，2次/d口服，連服20 d，停用10 d，30 d為1個療程。治療1個療程，贈藥（祛邪膠囊）1個療程。對照組在同觀察組相同的常規治療的基礎上服用安慰劑膠囊。安慰劑膠囊由北京食品藥物研究所加工生產，外觀、重量、顏色與祛邪膠囊一致。每次0.05 g/kg體質量，2次/d口服，連服20 d，停用10 d，30 d為1個療程。干預1個療程，贈藥（祛邪膠囊）1個療程。

常規治療包括單純中醫綜合治療和中西醫結合綜合治療，后者是在中醫綜合治療基礎上加用西醫對癥治療，包括止痛、營養治療等。其中，中醫綜合治療包括中藥湯劑、口服中成藥、靜脈中成藥等，治則治法以扶正為主。

患者入組后，在祛邪膠囊干預1個月及贈藥1個月后進行隨訪，此后每3個月對所有入組患者進行電話、網絡、門診或住院隨訪，隨訪內容主要是患者生存結局情況。

1.6 中醫治療優勢人群分組標準及根據隨訪結果的篩選

1）中醫治療優勢人群與非優勢人群分組標準。根據團隊前期研究基礎以及專家共識，對本研究“中醫治療優勢人群”定義如下：口服中藥≥3個月且截至患者死亡或最后一次隨訪時間達到較長的Ⅳ期生存期，其中基因全野生型>30個月;RAS突變型>24個月;BRAF突變型或未行基因檢測>18個月。2）3年隨訪生存結局情況。截至2021年2月末次隨訪，40例入組晚期結直腸癌患者中位隨訪時間為（19.7±10.2）個月，其中出現結局事件（各種原因所致死亡）18例（占45%）。本研究根據上述定義以及入組患者基線資料、隨訪結果（Ⅳ期生存時間），進一步劃分中醫治療優勢人群及非優勢人群。

1.7 觀察指標

1.7.1 糞便樣本采集及腸道菌群檢測

患者入組開始治療前采集新鮮糞便，要求患者在糞便采集前2周之內避免口服抗生素，采集3 d內避免進食酸奶及發酵食物。將患者新鮮糞便利用OMNIgene-GUT OME-200試管儲存（DNA Genitek Inc.Ottawa，Canada，批號：22001702552108，該試管能夠常溫穩定DNA達60 d。糞便樣本由中國上海美吉生物公司采用16srRNA分析方法進行質檢及檢測，具體過程：1）DNA抽提和PCR擴增：根據E.Z.N.A. soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量;用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對V3-V4可變區進行PCR擴增，擴增程序為：95 ℃預變性3 min，27個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp，型號：9700）。擴增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mM dNTPs，0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶;10 ng DNA模板。2）Illumina Miseq測序使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。構建文庫步驟：1）連接“Y”字形接頭;2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段;3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集;4）氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（Illumina MiSeq platform TruSeqTM DNA Sample Pre Kit Illumina，SanDiego，USA）。數據處理原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接：1）設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20 bp，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質控后長度低于50 bp的序列;2）根據重疊堿基Overlap將兩端序列進行拼接，拼接時Overlap之間的最大錯配率為0.2，長度需大于10 bp。3）根據序列首尾兩端的Barcode和引物將序列拆分至每個樣本，Barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除存在模糊堿基的序列。使用UPARSE軟件（Version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據97%的相似度對序列進行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫（SSU123），設置比對閾值為70%。

1.7.2 TB淋巴細胞亞群檢測

患者入組開始治療前取空腹靜脈血5 mL，由中國中醫科學院西苑醫院血液實驗室進行檢測，具體過程：經標本處理后，進行免疫分子檢測，T、B淋巴細胞亞群，Th1/Th2，NK細胞等。具體如下：在離心管內加入體積比為1∶2的淋巴細胞分離液和肝素化的新鮮稀釋血液，離心20 min（400×g），吸取界面層（一層白膜）單個核細胞，Hanks液洗滌2次，每次離心10 min（500×g），逐層冷凍至-80 ℃，1 d后移入液氮保存待測。

1.7.3 其他信息采集 1）中醫證型評分（中醫脾虛量表）：基于前期研究基礎及相關文獻，制定結直腸癌中醫脾虛量表，其中患者自評問題8項，程度從1至5。2）生命質量評分：采用埃德蒙頓癥狀評定量表（Edmonton Symptom Assessment Scale，ESAS），共包括11個問題，每個問題按程度分為0～10。

2 研究結果

2.1 晚期結直腸癌中醫優勢人群臨床特征分布

40例入組患者均接受口服中藥治療>3個月，其中根據Ⅳ期生存時間或截至末次隨訪時間，判定出中醫治療優勢人群28例，中醫非優勢人群12例。在中醫優勢人群中，符合Ⅳ期生存期，基因全野生型>30個月共8例，RAS突變型>24個月共9例，BRAF突變型或未行基因檢測>18個月共11例。

2.1.1 腫瘤相關臨床特征差異

40例晚期結直腸癌患者中，女性、年齡≥65歲、原發部位為右半結腸患者在中醫治療優勢人群所占比例較高，且中醫治療優勢人群中存在更少的死亡結局事件。見表1。

2.1.2 中醫脾虛癥狀分布差異

在8項中醫脾虛癥狀中，中醫治療優勢人群較非優勢人群存在更高“我吃涼東西后會腸鳴”（32% vs. 8%，P=0.17），“我有白天出汗、活動后加重的現象”（25% vs. 8%，P=0.6），“我感到沒有力氣說話”（18% vs. 0%，P=0.51）的出現頻率;而中醫治療非優勢人群較優勢人群存在更高的“我感到食欲不好”（25% vs. 7%，P=0.25），“我吃飯后肚子脹”（17% vs. 11%，P=0.92）。見圖1。

2.1.3 臨床癥狀（ESAS量表癥狀）分布差異

在10項臨床癥狀中，中醫治療優勢人群較非優勢人群存在更高“焦慮”（1.6±2.2 vs. 0.92±2.23，P=0.37）、“瘙癢”（1.79±2.17 vs. 0.83±2.04，P=0.2）程度;而中醫治療非優勢人群較優勢人群存在更高的“抑郁”（1.75±2.09 vs. 1.29±2.14，P=0.53）、“食欲差”（3.25±2.60 vs. 2.82±2.31，P=0.61）程度。見圖2。

2.2 中醫治療優勢與非優勢人群腸道菌群分布差異

納入分析40例患者中共39例完成了糞便樣本采集，共包含4 022 818條DNA序列。利用美吉生物云平臺（http：//cloud.majorbio.com）進行生物信息分析。OUT物種分析顯示所有樣本中共包含微生物物種門水平13種，綱水平21種，目水平37種，科水平74種，屬水平246種，種水平552種，OUT水平863種。Rank-Abundance曲線提示，所有樣本中種類較豐富。見圖3。Pan/Core曲線分析提示曲線平滑，所觀察樣本量充足。見圖4。

2.2.1 Alpha多樣性

在OUT水平進行Alpha多樣性分析顯示，中醫治療非優勢人群相比優勢人群具有更高的sobs指數，且差異有統計學意義（115.17±19.25 vs. 81.96±36.79，P=0.005）。見圖5。稀釋曲線分析提示各種樣本多樣性指數變化曲線平滑，提示樣本量充分。見圖6。

2.2.2 物種組成分析

在屬（Genus）水平對中醫治療優勢及非優勢人群進行物種組成韋恩圖分析，結果顯示2組共有196個共同菌種，中醫治療優勢人群組具有26種特殊菌種、非優勢人群具有24種特殊菌種。見圖7。

對不同組間樣本中優勢物種組成及豐度利用群落Bar圖進行比較分析，結果顯示，各組樣本中優勢物種在屬的水平均包含擬桿菌屬（Bacteroids），厚壁菌屬（Feacalibacterium），普雷沃屬（Prevotella）以及志賀菌屬（Escherichia-Shigella）。其中中醫治療優勢人群較非優勢人群具有更高比例的擬桿菌屬（31.1%vs.24.8%），而非優勢人群具有更高比例的志賀菌屬（9.7% vs. 6.9%）。在門水平上，中醫治療優勢人群厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B值）為0.84，中醫治療非優勢人群F/B值為1.16。見圖8。

2.2.3 Beta多樣性

利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）對中醫治療優勢及非優勢人群腸道菌群β多樣性進行分析，2組樣本中物種第一主成分（PC1解釋度為41.16%）出現一定程度的分離，而在第二主成分（PC2，解釋度22.65%）分離不顯著。見圖9。

2.2.4 物種差異分析

進一步對中醫治療優勢及非優勢人群樣本的物種差異性采用student-t檢驗進行顯著性檢驗。結果顯示，中醫治療優勢人群具有更高比例的擬桿菌屬（30.6% vs. 23.9%，P=0.33），普雷沃氏菌屬（5.7% vs. 3.9%，P=0.69），而中醫治療非優勢人群具有更高比例的志賀菌屬（9.4% vs. 7.2%，P=0.74），Ruminococcaceae_UCG-014（2.1% vs. 0.5%，P=0.02）。見圖10。

采用LEfSe多級物種差異性判別分析方法，從屬水平到屬水平分析不同組間菌群差異性，結果發現，真桿菌屬（Eubacterium）在中醫治療優勢人群組中較為優勢，而放線菌門（Actinobacteria）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）在中醫治療非優勢人群組中較為優勢。見圖11。

2.3 中醫治療優勢與非優勢人群TB淋巴細胞亞群

2.3.1 TB淋巴細胞亞群分析

比較2組TB淋巴細胞亞群分析結果發現，中醫治療優勢人群組較非優勢人群組具有更高的雙陰T細胞絕對值（89.6±82.0 vs. 37.1±16.5，P=0.01），以及非HLA依賴細胞毒性T細胞（83.0±43.6 vs. 28.4±18.3），P=0.01）。

2.3.2 TB淋巴細胞亞群與腸道菌群環境因子

為探討不同組間腸道菌群物種分布是否與TB淋巴細胞亞群相關，將TB淋巴細胞亞群中DNT（CD4、CD8雙陰性）T細胞、非HLA依賴細胞毒性T細胞絕對值作為環境因子，在屬（Genus）水平利用RDA分析法對環境因子與中醫治療優勢、非優勢人群樣本及物種之間關系進行解釋。結果顯示，DNT、非HLA依賴細胞毒性T細胞與不同組間樣本及物種之間的相關性顯示差異無統計學意義（P=0.14，0.24），但具有相關性趨勢。見圖12。對DNT（CD4、CD8雙陰性）T細胞、非HLA依賴細胞毒性T細胞絕對值與物種之間相關性進行屬（Genus）水平的Heatmap分析，結果顯示HLA依賴細胞毒性T細胞絕對值與糞厭氧棒狀菌（Anaerostipes）顯著負相關性（P=0.04）。見圖13。

3 討論

3.1 針對mCRC中醫治療優勢人群特征及其概念的再探討

本研究通過對本團隊一項中藥復方祛邪膠囊干預mCRC的RCT研究入組患者的3年隨訪以及中醫治療優勢人群的劃分，發現其主要臨床特征包括女性、年齡≥65歲、腫瘤原發部位為右半結腸，且中醫治療優勢人群中存在更少的死亡結局事件。此外，中醫治療優勢人群與非優勢人群在具體的癥狀負擔及中醫證型分布方面存在著一定的差異。上述結果與本團隊前期在晚期結直腸癌中醫優勢人群特征的研究結果相一致，為中醫治療優勢人群的判別提供了更進一步的臨床特征依據，并再次提示中醫對通過西醫常規治療難以獲益的mCRC人群治療中可能存在更為明顯的優勢，并能夠幫助患者獲得一定程度上的生存獲益。

3.2 腸道菌群對mCRC中醫治療優勢人群的預測價值和療效機制闡釋

研究結果發現中醫優勢人群及非優勢人群在腸道菌群多樣性、物種組成方面均存在一定的差異，如中醫治療優勢人群與中醫治療非優勢人群相比有更高比例的擬桿菌屬，而非優勢人群具有更高比例的志賀菌屬。腸道菌群的組成和多樣性受個體因素如年齡、性別、免疫系統和環境因素包括飲食習慣和藥物使用的影響[16]。研究表明，與結直腸癌患者相比，健康人群中厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門占有更明顯的優勢，表明上述細菌物種是CRC的保護因素[17]。其中擬桿菌屬是居住在人類胃腸道中最大的革蘭陰性菌，在維持健康腸道平衡穩定、營養物質的吸收代謝等方面發揮重要的作用[18]。因此擬桿菌屬的分布比例可能是mCRC中醫治療優勢人群的特征性生物標志物，也可能是中藥治療晚期結直腸癌潛在治療靶點。而非優勢人群中所占比例較高的志賀菌屬是革蘭陰性、不活動兼厭氧病原體，與大腸桿菌密切相關且具有極強的毒性，是導致胃腸道感染和急性痢疾的主要病原體之一[19]。有研究表明，志賀菌屬通過M細胞穿過結腸上皮層，從基底外側面入侵結腸上皮細胞從而造成感染[20]，在穿過結腸黏膜時產生多種去調節機制導致促炎環境啟動，伴隨大量免疫細胞的死亡，包括巨噬細胞焦磷酸癥以促進其在上皮內成活和沿結腸上皮擴散[21]。這一結果提示中醫治療非優勢人群其腸道內仍存在炎癥感染，且腸道內志賀菌屬豐度上升可能與中藥治療干預療效負相關。上述結果提示，通過16sRNA技術檢測mCRC患者腸道中富集的菌株、進而分析特定菌群標志物，有可能為評估晚期結直腸癌患者是否能從中醫治療中獲益提供客觀評估和參考依據。

3.3 TB淋巴細胞與腸道菌群在中醫治療優勢人群中的相互作用

在外周血TB淋巴細胞亞群分析結果發現，中醫治療優勢人群組較非優勢人群組具有更高比例的DNT細胞以及非HLA依賴細胞毒性T細胞。DNT細胞被認為是非傳統的T細胞，近年來一些研究表明DNT有很強的抗腫瘤作用[22]，并且擴增的DNT在體外產生高水平的干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）[23]，對惡性腫瘤有積極的治療作用。非HLA依賴細胞毒性T細胞是既表達自然殺傷細胞又表達T細胞相關受體的一類特殊的T淋巴細胞亞群，具有強大的抗腫瘤活性，可通過多種途徑直接殺傷腫瘤細胞[24]，并且自然殺傷性T細胞（Natural Killer T Cell，NKT細胞）細胞激活后可分泌細胞因子，從而激活免疫細胞起到抗腫瘤免疫的作用[25]。惡性腫瘤患者外周血中I型NKT細胞比例增高與良好的治療效果有關[26]，這與本研究的結果相一致。因此我們認為，中醫藥干預mCRC的療效機制很可能與調控NKT細胞參與機體免疫功能調節相關，其比例的增高有可能是中醫治療優勢人群治療療效的標志。對DNT細胞、非HLA依賴細胞毒性T細胞絕對值與物種之間相關性分析提示非HLA依賴細胞毒性T細胞絕對值與糞厭氧棒狀菌（Anaerostipes）呈顯著負相關性。目前已知糞厭氧棒狀菌具有預防和治療相關炎癥疾病的作用，但其具體與NKT細胞的相關作用尚未有文獻報道，還需進一步的研究探討。

3.4 局限性與結論

本研究存在以下局限性：首先，研究中患者糞便標本均在基線采集，而在患者長期隨訪過程中其腸道菌群多樣性及物種分布也可能發生一定的變化，因此下一步研究需將患者腸道菌群進行動態檢測，從而能夠為中醫治療優勢的預測提供更為翔實的參考依據。其次，本研究患者均參與了RCT研究入組，盡管干預時間僅一個月，但仍存在祛邪膠囊觀察組及安慰劑組之間的療效與菌群調節差異[27]，需要在今后的研究中控制這些可能的影響因素。此外，腸道菌群宏基因組技術能夠對不同組間患者腸道菌群的基因功能、基因組含量和差異進行分析，可為進一步明確微生物群在中醫藥治療晚期結直腸癌患者治療過程中的潛在作用機制提供更為深入的研究方法。目前研究基于外周血淋巴細胞亞群與腸道菌群多樣性進行相關分析，并不能代表腸道菌群在結直腸固有層中遇到的全部淋巴細胞亞群，可通過動物實驗設計對腸道局部菌群的標本進行采集和分析。另外，本研究是基于前期臨床研究進行的隨訪且樣本量較小，還需擴大樣本量來進行相關驗證，從而不斷完善中醫優勢人群特征。盡管如此，研究首次提出mCRC中醫治療優勢人群與非優勢人群在腸道菌群分布以及TB淋巴細胞亞群特征方面存在顯著差異且具有一定相關性，并為進一步闡釋中醫優勢人群特征及療效機制提供了必要的客觀科學依據。

參考文獻

[1]Zhang SW，Zheng RS，Zeng HM.Cancer incidence and mortality in China[J].JNCC，2020，1（1）：2-11.

[2]Dekker E，Tanis PJ，Vleugels J，et al.Colorectal cancer[J].Lancet，2019，394（10207）：1467-1480.

[3]Dienstmann R，Salazar R，Tabernero J.Molecular Subtypes and the Evolution of Treatment Decisions in Metastatic Colorectal Cancer[J].Am Soc Clin Oncol Educ Book，2018，38：231-238.

[4]Shao C，Zuo Q，Lin J，et al.Effect of Chinese Herbal Medicine on the Survival of Colorectal Cancer Patients With Liver-Limited Metastases：A Retrospective Cohort Study，2008 to 2017[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1534735419883687.

[5]苗雯蓉，劉寧寧，朱惠蓉，等.中醫藥聯合化療治療晚期大腸癌療效Meta分析[J].中華中醫藥學刊，2018，36（5）：1119-1124.

[6]Zhang T，He WT，Zi MJ，et al.Cohort Study on Prognosis of Patients with Metastatic Colorectal Cancer Treated with Integrated Chinese and Western Medicine[J].Chin J Integr Med，2018，24（8）：573-578.

[7]徐鈺瑩，孫凌云，張長，等.晚期結直腸癌中醫受益人群特征分析[J].中國中西醫結合雜志，2019，39（7）：804-809.

[8]Shamekhi S，Lotfi H，Abdolalizadeh J，et al.An overview of yeast probiotics as cancer biotherapeutics：possible clinical application in colorectal cancer[J].Clin Transl Oncol，2020，22（8）：1227-1239.

[9]Lamichhane P，Maiolini M，Alnafoosi O，et al.Colorectal Cancer and Probiotics：Are Bugs Really Drugs？[J].Cancers（Basel），2020，12（5）：1162.

[10]Zou S，Fang L，Lee MH.Dysbiosis of gut microbiota in promoting the development of colorectal cancer[J].Gastroenterol Rep（Oxf），2018，6（1）：1-12.

[11]Wei H，Chen L，Lian G，et al.Antitumor mechanisms of bifidobacteria[J].Oncol Lett，2018，16（1）：3-8.

[12]Agah S，Alizadeh AM，Mosavi M，et al.More Protection of Lactobacillus acidophilus Than Bifidobacterium bifidum Probiotics on Azoxymethane-Induced Mouse Colon Cancer[J].Probiotics Antimicrob Proteins，2019，11（3）：857-864.

[13]Zhong L，Zhang X，Covasa M.Emerging roles of lactic acid bacteria in protection against colorectal cancer[J].World J Gastroenterol，2014，20（24）：7878-7886.

[14]Wu M，Wu Y，Deng B，et al.Isoliquiritigenin decreases the incidence of colitis-associated colorectal cancer by modulating the intestinal microbiota[J].Oncotarget，2016，7（51）：85318-85331.

[15]Chen D，Yang Y，Yang P.Quxie Capsule Inhibits Colon Tumor Growth Partially Through Foxo1-Mediated Apoptosis and Immune Modulation[J].Integr Cancer Ther，2019，18：1534735419846377.

[16]Si H，Yang Q，Hu H，et al.Colorectal cancer occurrence and treatment based on changes in intestinal flora[J].Semin Cancer Biol，2021，70：3-10.

[17]Flint HJ，Scott KP，Louis P，et al.The role of the gut microbiota in nutrition and health[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2012，9（10）：577-589.

[18]Gibiino G，Lopetuso LR，Scaldaferri F，et al.Exploring Bacteroidetes：Metabolic key points and immunological tricks of our gut commensals[J].Dig Liver Dis，2018，50（7）：635-639.

[19]Ud-Din A，Wahid S.Relationship among Shigella spp.and enteroinvasive Escherichia coli（EIEC）and their differentiation[J].Braz J Microbiol，2014，45（4）：1131-1138.

[20]Phalipon A，Sansonetti PJ.Shigella′s ways of manipulating the host intestinal innate and adaptive immune system：a tool box for survival？[J].Immunol Cell Biol，2007，85（2）：119-129.

[21]Brunner K，Samassa F，Sansonetti PJ，et al.Shigella-mediated immunosuppression in the human gut：subversion extends from innate to adaptive immune responses[J].Hum Vaccin Immunother，2019，15（6）：1317-1325.

[22]Alnaggar M，Xu Y，Li J，et al.Allogenic Vγ9Vδ2 T cell as new potential immunotherapy drug for solid tumor：a case study for cholangiocarcinoma[J].J Immunother Cancer，2019，7（1）：36.

[23]Mou Z，Liu D，Okwor I，et al.MHC class Ⅱ restricted innate-like double negative T cells contribute to optimal primary and secondary immunity to Leishmania major[J].PLoS Pathog，2014，10（9）：e1004396.

[24]Shekhar S，Joyee AG，Yang X.Dynamics of NKT-Cell Responses to Chlamydial Infection[J].Front Immunol，2015，6：233.

[25]Coquet JM，Kyparissoudis K，Pellicci DG，et al.IL-21 is produced by NKT cells and modulates NKT cell activation and cytokine production[J].J Immunol，2007，178（5）：2827-2834.

[26]郭偉春，梁俊青，賈紹昌.NKT細胞的生物特性及其在抗腫瘤免疫中的作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2019，26（8）：921-924.

[27]Sun L，Yan Y，Chen D，et al.Quxie Capsule Modulating Gut Microbiome and Its Association With T cell Regulation in Patients With Metastatic Colorectal Cancer：Result From a Randomized Controlled Clinical Trial[J].Integr Cancer Ther，2020，19：1534735420969820.

（2021-03-10收稿 責任編輯：徐穎）