加減黃連溫膽湯對血管性癡呆模型大鼠炎癥反應的影響

竇金金 齊珊 張喜武

摘要 目的：觀察加減黃連溫膽湯對血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）模型大鼠腦組織白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）mRNA、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）mRNA和環氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）mRNA的影響，明確炎癥反應對VD的影響，探討加減黃連溫膽湯對VD大鼠的炎癥作用機制。方法：采用大鼠雙側頸總動脈間斷性結扎的方法，復制VD大鼠模型。通過逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction，RT-PCR）法試劑盒檢測TNF-αmRNA、IL-1βmRNA和COX-2 mRNA，并描繪各驗證因子數據表達變化。結果：模型組與空白組、假手術組比較，模型組腦組織IL-1βmRNA和TNF-αmRNA及COX-2mRNA的表達明顯增多，有顯著性差異;加減黃連溫膽湯與模型組比較，加減黃連溫膽湯可使IL-1βmRNA和TNF-αmRNA及COX-2mRNA的表達下調，有顯著性差異。結論：加減黃連溫膽湯可通過抑制炎癥介質IL-1βmRNA、TNF-αmRNA及COX-2 mRNA的表達，發揮對VD模型大鼠的治療作用。

關鍵詞 加減黃連溫膽湯;血管性癡呆;炎癥反應;逆轉錄-聚合酶鏈反應;白細胞介素-1βmRNA;腫瘤壞死因子-αmRNA;環氧合酶-2 mRNA

Abstract Objective：To observe the effects of modified Huanglian Wendan Decoction on interleukin-1β（IL-1β）mRNA，tumor necrosis factor-α（TNF-α） mRNA and cyclooxygenase-2（COX-2）mRNA in the brain tissue of vascular dementia（VD）model rats.To clarify the influence of inflammation on VD，and to explore the inflammatory mechanism of modified Huanglian Wendan Decoction on VD rats.Methods：The rat model of VD was replicated by intermittent ligation of bilateral common carotid arteries in rats.TNF-αmRNA，IL-1βmRNA and COX-2 mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）kit，and the expression changes of each verification factor data were depicted.Results：Compared with the blank group and the sham operation group，the expression of IL-1βmRNA，TNF-αmRNA and COX-2mRNA in the brain tissue of the model group was significantly increased，and there was a significant difference.Compared with the model group，modified Huanglian Wendan Decoction，can down-regulate the expression of IL-1βmRNA，TNF-αmRNA and COX-2mRNA，with significant differences.Conclusion：Modified Huanglian Wendan can reduce the inhibition of inflammatory factor the expression of IL-1βmRNA，TNF-αmRNA and COX-2mRNA，and play a role in inhibiting inflammation.

Keywords Modified Huanglian Wendan Decoction; Vascular dementia; Inflammation reverse transcription-polymerase chain reaction; Interleukin-1βmRNA; Tumor necrosisfactor-α; TNF-αmRNA; Cyclooxygenase-2mRNA

中圖分類號：R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.012

血管性癡呆指由各類腦血管疾病導致的腦功能障礙而產生的一種獲得性智能損害綜合征[1]，患病者有不同程度的記憶、認知、行為等認知障礙[2]。中藥方劑可通過抑制神經細胞凋亡、改善血流變、調節神經遞質、激活腦細胞、抗氧化損傷等作用治療VD，尤其是抑制炎癥反應作用[3-4]。眾多中醫大家普遍認為VD病機為髓海虛空、臟腑衰退、痰瘀互結、濁毒化生，導致腦絡痹阻、絡脈瘀滯、神志失統[5-7]。黃連溫膽湯是化痰的經典方，在此基礎上加用活血化瘀類藥物，可共奏化痰活血之功。本研究應用RT-PCR等技術，在VD模型基礎上完成VD模型大鼠炎癥反應影響研究，以利于指導臨床應用，以期為VD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取清潔級健康雄性Wistar大鼠100只，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號為2017023521，倫理審批號為2017031001。所有大鼠在同一動物房中飼養，室溫為22～26 ℃，相對濕度為55%左右，正常光照。適應性飼養2周，飼料及飲水均經過高溫蒸汽滅菌。

1.1.2 藥物

加減黃連溫膽湯（modified Huanglian Wendan，HLWD）：HLWD飲片購于哈爾濱松茂藥材公司。中藥飲片加水煎煮，分別制備成濃度為1 g/mL（高劑量）、0.5 g/mL（低劑量）的藥液，于4 ℃冰箱保存備用。大鼠給藥劑量依據人與大鼠用藥換算關系計算，給藥體積按2 mL/100 g體質量計算。陽性對照藥鹽酸多奈哌齊片（安理申，法國PFIZER PGM公司，進口藥品注冊證號：BH20040114，分包裝批準文號：國藥準字J20160020），5 mg/片。

1.1.3 試劑與儀器

1）試劑：硝普鈉（批號：20170405）：北京制藥工業研究所實驗藥廠;TRIzol試劑（批號：269201）：美國Invitrogen公司;RT-PCR試劑盒（批號：20170613）：北京索萊寶公司。2）儀器：DMS-2MORRIS水迷宮系統：中國醫學科學院藥物研究所;702超低溫冰箱：ULT Freezer美國;OptimaTM XL-look Ultra centrifuge高速低溫離心機：BECKMAN美國;Apllied Biosystems 2700 PE PCR擴增儀：Singarpore;DYY-8B穩壓穩流定時電泳儀：北京六一廠;Labworks 4.5 UVP紫外凝膠成像系統：Cambridge英國。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

取適應性飼養2周的清潔級Wistar大鼠15只不做任何處理為空白組，剩余85只大鼠術前禁食水，稱重。腹腔注射10%的烏拉坦麻醉，并置于手術臺上仰臥固定，消毒頸部，切開頸部皮下組織，分離雙側頸總動脈（Common Carotid Arteries，CCA），用動脈夾夾閉雙側CCA20 min（I20），后去除動脈夾通血10 min（R10），再夾閉20 min（I20），如此反復3次，即I20-R10-I20-R10-I20-R10，末次腹腔注射硝普鈉，縫合傷口后置于籠中繼續飼養。假手術組僅分離雙側CCA后即縫合。在實驗過程中為了減少低溫對模型腦缺血損傷的保護作用，使大鼠肛溫保持在37 ℃左右。

手術3 d后，模型大鼠行動遲緩，活動減少。將100只大鼠中所有存活動物分別進行Morris水迷宮實驗，記錄每只大鼠逃避潛伏期，以空白組大鼠的均值為參考值，計算模型組大鼠各鼠平均逃避潛伏期與參考值之差占平均逃避潛伏期的比值，該值大于20%為癡呆，其中，比值20%～30%為輕度癡呆，比值30%～40%為中度癡呆，比值40%為重度癡呆。達不到癡呆標準者被剔除出實驗。

1.2.2 動物分組與給藥

Wistar大鼠隨機分成6組：空白組（15只）、假手術組（17只）、模型組（17只）、安理申對照組（17只）、HLWD低劑量組（黃低組，17只）、HLWD高劑量組（黃高組17只）。以灌胃形式給藥，體積為2 mL，陽性對照組按照0.45 mg/kg給藥，其他組給予同體積的蒸餾水，給藥周期為28 d。

1.2.3 觀察指標與方法

給藥28 d后，將大鼠麻醉，打開胸腔，向升主動脈插管，首先用0.9%的生理鹽水沖洗，并剪開右心耳，待大鼠雙目虹膜以及肝臟變白后，再灌入4%多聚甲醛溶液，最后開顱取全腦勻漿備用。稱取大鼠腦組織、海馬50～100 mg/mL Trizol組織，置于冰盒上，研磨成粉末狀。室溫放置5 min，加入氯仿（0.2 mL/mL Trizol），劇烈振蕩15 s，放置2～3 min。在4 ℃以1.2×104 r/min離心（離心半徑為6 cm）15 min，取上清（混合物分三層，下面是酚-氯仿-蛋白質層，中間是DNA層，最上層為水性上清含mRNA），收集上層無色液體置于1.5 mLEppendorf離心管，棄沉淀管（可保留在-70 ℃）。加入等體積異丙醇（1 mLTrizol加入0.5 mL），混勻，出現沉淀后放置10 min。在4 ℃以1.2×104 r/min，離心（離心半徑為6 cm）10 min棄上清，留沉淀，加入1 mL 4 ℃的75%乙醇洗滌。在4 ℃以1.0×104 r/min離心（離心半徑為6 cm）10 min。將沉淀溶于30 μLDEPC水中。測量RNA濃度及純度。余下RNA分裝置于-70 ℃備用。

1）取0.2 mL PCR管，分別加入RNA（1 mg/mL）1 μL、DEPC處理水6 μL、OligodT11 μL，金屬浴70 ℃ 5 min，立即置于冰盒上放置10 min。再向體系中加入4 μL 5×反轉錄酶buffer、4 μL dNTP（2.5 mmol/L）、2 μL DTT（0.1 mol/L）、1 μL Rnase Inhabitor、1 μL mol/L-MLV，37 ℃1 h，95 ℃5 min，-20 ℃分裝凍存。

2）聚合酶鏈反應：引物和內參序列分別如表1所示（由美國NCBI數據庫提供RNA全序列，用Primer3引物設計軟件設計）。

3）反應體系：5 μL 10×PCR buffer，4 μL DNTP，1 μL上游引物50 mmol/L，1 μL下游引物50 mmol/L，1 μL cDNA，3 μL Mgcl2，1 μL Taq DNA Polymerase，DEPC-treated water補足至50 μL。

4）PCR條件：IL-1β、TNF-α、COX-2退火溫度分別為53.5 ℃、56.8 ℃、53.5 ℃。

95 ℃預變性6 min，94 ℃變性30 s，53.5～56.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復33個循環，72 ℃延伸10 min，4 ℃10 min，-20 ℃分裝保存。

5）電泳及圖像分析：取5 L上述反應產物于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，掃描拍照和分析擴增產物電泳強度，并依據目的基因IL-1β、TNF-α、COX-2與內參基因β-actin電泳條帶密度比值，分析基因表達水平變化。

1.3 統計方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，數據采用均數±標準差（±s）表示，對逃避潛伏期采用多因素方差分析比較，其他組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況

造模前大鼠皮毛亮澤光滑，飲食正常，體格健壯，喜活動，行動敏捷。手術過程中，CCA阻斷后出現短暫性暈厥，雙目變白，皮溫減低，呼吸頻率先快后慢，復位反射消失。造模后早期大鼠運動量減少，嗜睡，飲食減少，隨后出現精神萎靡、豎毛或毛發稀疏無光而枯槁、反應遲鈍，而無肢體運動障礙，大部分造模后大鼠出現虹膜淡白，一側眼裂的縮小。

給藥后，各組一般狀況均有不同程度的緩解。但模型組大鼠進食、排便和活動量減少，體質量減輕，精神不振，反應遲鈍，毛發干枯無光澤，尾部有色素沉著且日漸加重。以上癥狀在假手術組大鼠中均未出現。在給藥階段，假手術組、模型組、安理申組、黃低組、黃高組死亡數分別為1只、2只、1只、2只、1只，其主要死亡原因為術后感染和術后顱內壓力過高導致顱內出血，死亡大鼠不列入統計分析，每組剩余大鼠做指標檢測。

2.2 HLWD對VD大鼠腦組織IL-1βmRNA、TNF-αmRNA和海馬COX-2mRNA的影響

2.2.1 IL-1βmRNA表達水平分析 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織IL-1βmRNA水平升高（P<0.05）;與模型組比較，黃高低組、安理申組對腦組織IL-1βmRNA水平均有明顯的下調作用（P<0.05）;各觀察組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1，表2。

2.2.2 TNF-αmRNA表達水平分析 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織TNF-αmRNA水平升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，黃高組、安理申組對腦組織TNF-αmRNA水平均有明顯上調作用，差異有統計學意義（P<0.05），黃低組差異無統計學意義（P>0.05）。黃高組與安理申比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2，表3。

2.2.3 COX-2mRNA表達水平分析

與假手術組比較，模型組大鼠海馬區COX-2mRNA水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，黃高低組、安理申組對海馬區COX-2mRNA水平下調顯著，差異有統計學意義（P<0.05）;黃高組與安理申組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3，表4。

3 討論

VD是迄今世界唯一公認可以防治的癡呆疾病，極早治療或有可逆性，尋找其發病機制，對于早期診斷和早期治療意義巨大[8-9]。張伯禮院士提出治療VD要以“補腎為要、痰瘀并治”，腎精虧虛、髓海空虛、瘀血痰濁亦為病情變化之根源。黃連溫膽湯出自《六因條辨》卷上，有理氣化痰的功效，符合張伯禮院士提出治療VD要以“補腎為要、痰瘀并治”理論[10-12]。此方中半夏為君藥，可燥濕化痰;陳皮可理氣和中，茯苓滲濕健脾以消痰，黃芪與此二味藥共奏益氣、理氣之效;決明子清瀉肝火、潤腸通便，又兼補腎陰，黃連清熱燥濕、瀉火解毒;竹茹利膽和胃，葛根清熱生津，此二味共防燥熱藥傷陰;丹參具有活血化瘀作用，可祛除瘀阻之邪;甘草，益氣和中，可調和諸藥[13-14]。

炎癥反應與腦組織的損傷、缺血、缺氧及再灌注等密切相關[15-16]。灌注早期產生的炎癥介質主要包括TNF-α、IL-1β等，可介導炎癥反應和免疫反應，可放大炎癥反應，是機體對創傷產生的適應性反應[17-18]。COX-2是PGS合成中的關鍵限速酶，為酶的誘導型，當細胞受到IL-1β、TNF-α等各種刺激時迅速合成，促進炎癥反應和組織損傷[19-20]。

在模型組大鼠腦組織IL-1βmRNA表達水平明顯升高，提示缺血再灌注后，可誘導腦內炎癥反應發生，炎癥介質IL-1β表達增強。HLWD高、低劑量組及安理申對照組IL-1βmRNA表達水平較VD模型組有明顯的下調作用，提示HLWD高、低劑量組和安理申組腦組織炎癥反應較模型組減輕。HLWD高、低劑量組及安理申對照組TNF-αmRNA表達水平均較VD模型組下降，提示HLWD高、低劑量組和安理申組腦組織炎癥反應較模型組減輕，這提示HLWD和安理申均有抑制VD大鼠模型腦內慢性炎癥、TNF-αmRNA及IL-1βmRNA表達的作用，這可能是二者對抗VD的機制之一。HLWD高、低劑量組及安理申對照組COX-2mRNA表達水平均較VD模型組下降，提示HLWD高、低劑量組和安理申組腦組織炎癥反應較模型組減輕。HLWD可減少COX-2的表達，或通過對炎癥介質（IL-1β和TNF-α）的抑制作用而發揮對COX-2的基因和蛋白質表達的干預作用，起到抑制腦缺血后的炎癥反應，發揮腦保護的作用。

參考文獻

[1]石苗茜，劉衛平.血管性癡呆發病機制研究進展[J].第四軍醫大學學報，2007，28（9）：860-863.

[2]單永琳，劉國華.血管性癡呆的研究現狀[J].醫學綜述，2017，23（8）：1589-1594.

[3]陳永真，麻春杰.近5年中醫藥治療血管性癡呆研究概述[J].山東中醫雜志，2020，39（1）：83-86.

[4]劉川楊，肖凌勇，屠建鋒，等.中藥復方治療血管性癡呆的機制研究進展[J].中華中醫藥雜志，2019，34（2）：696-701.

[5]陳靜，吳林，伍媛，等.從五臟論治血管性癡呆的研究進展[J].湖南中醫雜志，2020，36（1）：143-145.

[6]王佳彬，沈曉明，黃艷麗.血管性癡呆的中西醫研究進展[J].中醫研究，2020，33（1）：71-74.

[7]朱世瑞，馬云枝.從“毒損腦絡”探討血管性癡呆的機理[J].河南中醫，2015，35（4）：738-740.

[8]周流暢，龐喜樂，劉立瑾，等.辨證施治血管性癡呆研究進展與思考[J].中國中醫藥現代遠程教育，2018，16（15）：146-148.

[9]Thal DR，Grinberg LT，Attems J.Vascular dementia：different forms of vessel disorders contribute to the development of dementia in the elderly brain[J].Exp Gerontol，2012，47（11）：816-824.

[10]崔遠武，江豐，馬妍，等.張伯禮教授治療老年期癡呆經驗[J].中華中醫藥雜志，2015，30（8）：2783-2786.

[11]郭芳芳，陸暉.血管性癡呆的病因病機研究進展[J].中醫臨床研究，2017，9（29）：138-141.

[12]李強，耿秀超，聶金濤，等.中醫藥治療血管性癡呆研究概況[J].中醫臨床研究，2018，10（12）：32-36.

[13]張風麗，范琳琳，李寒，等.《六因條辨》之黃連溫膽湯臨床運用淺析[J].湖南中醫雜志，2018，34（11）：106-107.

[14]姜浩，劉巧巧，余仁歡.黃連溫膽湯現代研究進展[J].北京中醫藥，2014，33（4）：314-316.

[15]楊小鈺，黃海紅，諶澤芳，等.腦缺血再灌注后炎癥反應研究進展及中西醫結合防治思路[J].中國現代醫藥雜志，2019，21（12）：95-99.

[16]Evzelman MA，Mityaeva EV，Lashkhiia IB，et al.Acute cerebral ischemia and inflammation[J].Zh Nevrol Psikhiatr Im S S Korsakova，2019，119（12.Vyp.2）：73-80.

[17]Lambertsen KL，Biber K，Finsen B.Inflammatory cytokines in experimental and human stroke[J].J Cereb Blood Flow Metab，2012，32（9）：1677-1698.

[18]江高峰，秦旭平，李潔.免疫炎癥反應在動脈粥樣硬化中作用的研究進展[J].中南醫學科學雜志，2015，43（2）：212-216.

[19]Ferrer MD，Busquets-Cortés C，Capó X，et al.Cyclooxygenase-2 Inhibitors as a Therapeutic Target in Inflammatory Diseases[J].Curr Med Chem，2019，26（18）：3225-3241.

[20]Yao C，Narumiya S.Prostaglandin-cytokine crosstalk in chronic inflammation[J].Br J Pharmacol，2019，176（3）：337-354.

（2020-10-14收稿 責任編輯：楊覺雄）