高效液相色譜法同時(shí)測定生活用紙及紙制品中19種有機(jī)抗菌劑

綦 艷，李錦清，陳滿英，伍尚森，唐楚林，劉德群

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東 順德 528300）

生活用紙及紙制品在生產(chǎn)加工和貯藏過程中常會(huì)使用有機(jī)抗菌劑，以抑制和殺滅細(xì)菌、霉菌、藻類等，達(dá)到防腐、抑菌效果，增加紙制品的貯藏和使用壽命［1］。常用的有機(jī)抗菌劑有對羥基苯甲酸酯類、季銨鹽類（如苯扎氯銨等）、異噻唑啉酮類等，由于缺乏完善的檢測標(biāo)準(zhǔn)，某些有機(jī)抗菌劑并未列入監(jiān)管項(xiàng)目，可能會(huì)導(dǎo)致生活用紙質(zhì)量存在安全隱患。有機(jī)抗菌劑在短期內(nèi)對環(huán)境和人體的危害不明顯，但長期積蓄達(dá)到一定含量后，對人體和環(huán)境產(chǎn)生的危害不能忽視。氯苯酚類物質(zhì)常用作木材防腐劑，起到抗菌防腐作用，也是制漿造紙行業(yè)中氯化消毒和漂白過程中的主要副產(chǎn)物之一。這些物質(zhì)若殘留于紙中或作為廢液排放至環(huán)境中，被人體吸收后對肝、腎、肺會(huì)有損傷，特別是經(jīng)生物和環(huán)境的富集和累積效應(yīng)，毒性大大增強(qiáng)，被列為疑似致癌物質(zhì)［2］，許多國家對氯苯酚類物質(zhì)的使用有嚴(yán)格限制。因此，建立生活用紙及紙制品中對羥基苯甲酸酯類、季銨鹽類、氯苯酚類等有機(jī)抗菌劑的檢測方法具有十分重要的意義。

目前有機(jī)抗菌劑的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）［3－5］、氣相色譜法（GC）［6］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）［7－11］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）［12－14］以及超高效液相色譜－靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法［15］。其中HPLC－MS/MS法和GC－MS法靈敏度高，適用于低含量有機(jī)抗菌劑檢測，但儀器昂貴，維護(hù)成本高，在生產(chǎn)企業(yè)中難推廣；GC法測定氯苯酚類抗菌劑通常需要繁瑣的衍生步驟。HPLC法無需衍生即可同時(shí)檢測多種有機(jī)抗菌劑，普適性強(qiáng)，維護(hù)成本低，具有在企業(yè)中推廣應(yīng)用的潛力，可為企業(yè)的紙制品質(zhì)量控制提供可靠的技術(shù)支撐。

關(guān)于紙制品中有機(jī)抗菌劑檢測的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在食品接觸類紙制品方面［16－18］，而生活用紙及紙制品的報(bào)道較少。生活用紙及紙制品中可能添加的有機(jī)抗菌劑種類較多，若對每一類抗菌劑進(jìn)行檢測，則存在效率低、成本高等不足。針對氯苯酚類、季銨鹽類、對羥基苯甲酸酯類等多種有機(jī)抗菌劑同時(shí)檢測的方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜建立了生活用紙及紙制品中19種有機(jī)抗菌劑（包括7種氯苯酚類、6種季銨鹽類和6種對羥基苯甲酸酯類化合物）的分析方法，并將其用于實(shí)際樣品的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀，配Waters 2998光電二極管陣列（PDAD）檢測器（美國Waters公司）；SIGMA 3-18K高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；IKA渦旋混合器（德國IKA公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司）；Milli-Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）；DT-502A電子天平（常熟市金羊砝碼儀器有限公司）；JP-C300超聲波清洗機(jī)（廣州吉普超聲波電子設(shè)備有限公司）。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；磷酸（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；四丁基硫酸氫銨（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

7種氯苯酚類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：對氯間二甲苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4，6-三氯苯酚、2，3，4，5-四氯苯酚、2，3，4，6-四氯苯酚、2，3，5，6-四氯苯酚、五氯苯酚（純度均不低于97%，Dr．Ehrenstorfer公司）。6種季銨鹽類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：苯扎氯銨、西吡氯銨、勞拉氯銨、芐索氯銨、地喹氯銨、西他氯銨（純度均不低于97%，北京曼哈格生物科技有限公司）。6種對羥基苯甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)品：對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸異丁酯（純度均不低于99%，Dr．Ehrenstorfer公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0．01 mg）分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻后配得質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于－20℃保存。分別精密移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用甲醇－水溶液（1∶1，體積比）稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物的質(zhì)量濃度分別在0．05～20 mg/L、0．1～20 mg/L、0．02～50 mg/L之間。

1.3 樣品前處理

取代表性樣品，剪碎至5 mm×5 mm以下，混勻，稱取2．0 g（精確至0．01 g）試樣置于50 mL離心管中，加入20 mL 0．5%甲酸－甲醇溶液，室溫超聲提取20 min，9 000 r/min離心3 min，用布氏漏斗抽濾，濾液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中。從布氏漏斗中取出殘?jiān)儆?0 mL 0．5%甲酸－甲醇溶液超聲提取10 min，9 000 r/min離心3 min后，用布氏漏斗抽濾，濾液合并于同一雞心瓶中，45℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1 mL，氮?dú)獯蹈桑?．0 mL甲醇－水溶液（1∶1，體積比）溶解，過0．22μm有機(jī)系濾膜，待測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate AQ C18柱（250 mm×4．6 mm，5μm）；柱溫：25℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為甲醇，C為0．05%磷酸水溶液（含0．475 3 g四丁基硫酸氫銨），梯度洗脫程序見表1；進(jìn)樣體積：50μL；檢測波長：PDAD檢測器，波長范圍為191～400 nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將19種有機(jī)抗菌劑的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液分別用甲醇－水溶液（1∶1）稀釋100倍后，在191～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。結(jié)果顯示，氯苯酚類化合物在210 nm和230 nm處均有較強(qiáng)吸收；季銨鹽類化合物僅在210 nm有較強(qiáng)吸收，其他波長的吸收很弱；對羥基苯甲酸酯類化合物在210 nm和256 nm處均有較強(qiáng)的特征吸收峰。由于210 nm波長易受雜質(zhì)干擾，通常應(yīng)避免作為檢測波長，但本實(shí)驗(yàn)中季銨鹽類化合物在C18色譜柱上的保留能力較強(qiáng)，出峰時(shí)間較遲，保留時(shí)間均在45 min后，與雜質(zhì)分離充分，不易受到雜質(zhì)峰干擾。因此，綜合考慮19種有機(jī)抗菌劑的響應(yīng)值和干擾情況，氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物分別以230、210、256 nm為檢測波長。采用PDAD檢測器在191～400 nm范圍進(jìn)行監(jiān)測，提取特定波長進(jìn)行定量，其他特征吸收光譜圖輔助定性。

2.2 流動(dòng)相的選擇

氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物的性質(zhì)差異較大，其中氯苯酚類化合物包含三氯苯酚同分異構(gòu)體（2，4，5-三氯苯酚與2，4，6-三氯苯酚）和四氯苯酚同分異構(gòu)體（2，3，4，5-四氯苯酚、2，3，4，6-四氯苯酚與2，3，5，6-四氯苯酚），這些同分異構(gòu)體的物理化學(xué)性質(zhì)差別不大，色譜行為相似，因此建立一種完全分離19種有機(jī)抗菌劑的液相色譜法難度較大。本研究采用流動(dòng)相中添加離子對試劑，磷酸調(diào)節(jié)pH值，再結(jié)合梯度改變流動(dòng)相比例和流速的方式，使19種有機(jī)抗菌劑的色譜峰完全分離。

氯苯酚類和對羥基苯甲酸酯類化合物均為弱酸性化合物，較易電離，在流動(dòng)相中添加少量酸可抑制電離，使其形成中性分子，改善其在C18色譜柱上的分離度和色譜峰形。季銨鹽類為弱堿性化合物，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)酸性流動(dòng)相條件下該類化合物在C18色譜柱上也具有較好的分離度和色譜峰形。考察了乙腈、甲醇分別與0．05%甲酸水溶液、0．05%乙酸水溶液和0．05%磷酸水溶液組合作為流動(dòng)相體系對19種有機(jī)抗菌劑的分離效果。結(jié)果表明，上述流動(dòng)相組合均不能使19種有機(jī)抗菌劑的色譜峰完全分離，部分季銨鹽類和氯苯酚類化合物的色譜峰重疊，但以乙腈－0．05%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，達(dá)到基線分離的色譜峰最多，峰形最好。在流動(dòng)相中添加適量四丁基硫酸氫銨，可提高結(jié)構(gòu)特殊、不易分離化合物的分離效果；由于甲醇的粘度比乙腈大，且兩者極性存在差異，適量加入甲醇可調(diào)整流動(dòng)相的極性，提高分離度。因此，實(shí)驗(yàn)以乙腈和0．05%磷酸水溶液流動(dòng)相為基礎(chǔ)，在乙腈中加入甲醇，在0．05%磷酸水溶液中加入四丁基硫酸氫銨離子對試劑，以進(jìn)一步提高色譜分離度。通過比較甲醇、四丁基硫酸氫銨、磷酸的加入量，并結(jié)合流速的變化，確定優(yōu)化的流動(dòng)相及梯度洗脫程序如“1．4”所示。

2.3 色譜柱的選擇

分別考察了Phenomenex Luna C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Thermo Hypersil GOLD C18（250 mm×4．6 mm，5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4．6 mm，5μm）和Welch Ultimate AQ C18（250 mm×4．6 mm，5μm）5種色譜柱對19種有機(jī)抗菌劑的分離效果。結(jié)果表明，耐100%水相的Welch Ultimate AQ C18色譜柱在優(yōu)化色譜條件下能使19種有機(jī)抗菌劑的色譜峰完全分離，其他4種C18色譜柱均存在部分色譜峰重疊，分離效果較差。因此，選擇Welch Ultimate AQ C18（250 mm×4．6 mm，5μm）作為分離色譜柱。優(yōu)化條件下，19種有機(jī)抗菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mg/L）在210 nm檢測波長下的色譜圖見圖1。

圖1 19種有機(jī)抗菌劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖（5 mg/L）Fig．1 Chromatogram of 19 organic antibacterial agents standard solution（5 mg/L）the peak numbers denoted were the same as those in Table 2

2.4 提取溶劑的選擇

根據(jù)待測化合物性質(zhì)，比較了甲醇作為提取溶劑時(shí)不加酸和加入少量甲酸的提取效果。結(jié)果顯示，加入少量甲酸的提取溶劑能使氯苯酚類化合物的回收率提高約10%，對其他物質(zhì)無影響，因此在提取溶劑中加入少量甲酸。氯苯酚類和對羥基苯甲酸酯類化合物的分子結(jié)構(gòu)均含有羥基，具有一定極性，與季銨鹽類化合物均易溶于甲醇、乙腈、丙酮等有機(jī)溶劑。本研究分別以甲酸酸化的甲醇、乙腈、丙酮作為提取溶劑，在相同實(shí)驗(yàn)條件下對自制的添加19種有機(jī)抗菌劑標(biāo)準(zhǔn)品的樣品進(jìn)行檢測，比較提取效果。結(jié)果表明，甲酸酸化的丙酮作為提取試劑時(shí)，提取液雜質(zhì)最多，干擾目標(biāo)物的測定；甲酸酸化的乙腈對氯苯酚類化合物的提取效果較差，回收率低；甲酸酸化的甲醇作為提取溶劑時(shí)，雜質(zhì)較少，因此選擇甲酸酸化的甲醇作為提取溶劑。進(jìn)一步比較了甲酸添加量對提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)甲酸的最佳添加量為0．5%，此時(shí)19種有機(jī)抗菌劑的提取回收率均達(dá)到70%以上，繼續(xù)增加甲酸比例，回收率變化不明顯。因此，本研究以0．5%甲酸－甲醇溶液作為提取溶劑。

2.5 提取次數(shù)的優(yōu)化

采用0．5%甲酸－甲醇溶液作為提取溶劑，以濕紙巾、紙巾、紙杯作為基質(zhì)對提取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。由于紙制品對提取溶劑的吸附作用很強(qiáng)，即使離心后也不能使樣品與提取溶劑完全分離，本研究采用布氏漏斗抽濾以充分回收被紙制品吸附的提取溶劑，提高目標(biāo)物的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用布氏漏斗抽濾，樣品提取2次即可達(dá)到充分提取，上述3種基質(zhì)中19種有機(jī)抗菌劑的回收率均大于70%，因此選擇提取2次。

2.6 線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化的條件下，對19種有機(jī)抗菌劑的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以目標(biāo)化合物的峰面積為縱坐標(biāo)（y），對應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/L）作線性回歸方程。結(jié)果顯示，氯苯酚類、季銨鹽類和對羥基苯甲酸酯類化合物分別在0．05～20 mg/L、0．1～20 mg/L、0．02～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r≥0．996 0；按信噪比（S/N）不低于3時(shí)計(jì)算檢出限（LOD），五氯苯酚的檢出限為0．1 mg/kg，其他6種氯苯酚類化合物的檢出限均為0．2 mg/kg；季銨鹽類化合物的檢出限均為0．3 mg/kg；對羥基苯甲酸酯類化合物的檢出限均為0．05 mg/kg（見表2）。

表2 19種有機(jī)抗菌劑的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及檢出限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients（r）and limits of detection（LOD）of 19 organic antibacterial agents

2.7 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，選擇經(jīng)測定不含待測物質(zhì)的濕紙巾、紙巾、紙杯為代表樣品，分別進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其中對羥基苯甲酸酯類化合物的加標(biāo)水平為0．2、0．4、2．0 mg/kg；氯苯酚類和季銨鹽類化合物的加標(biāo)水平為1．0、2．0、10．0 mg/kg；每個(gè)濃度水平平行測定6次，平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3。結(jié)果顯示，19種有機(jī)抗菌劑的平均回收率為74．8%～101%，RSD為2．2%～5．6%，具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足生活用紙及紙制品中19種有機(jī)抗菌劑的分析要求。

表3 19種有機(jī)抗菌劑的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Mean recoveries and relative standard deviations（RSD）of 19 organic antibacterial agents（n=6）

（續(xù)表3）

2.8 實(shí)際樣品檢測

從市場上購買濕紙巾、紙巾、紙杯各10批次，采用本方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，紙巾和紙杯中均未檢出19種有機(jī)抗菌劑；濕紙巾中未檢出氯苯酚類化合物，但有2批次濕紙巾檢出對羥基苯甲酸甲酯，含量分別為11．3、15．4 mg/kg；1批次濕紙巾檢出芐索氯銨，含量為132．3 mg/kg；1批次濕紙巾同時(shí)檢出芐索氯銨和西吡氯銨，含量分別為152．2、246．5 mg/kg。圖2為代表性濕紙巾陽性樣品的色譜圖。

圖2 濕紙巾陽性樣品的色譜圖Fig．2 Chromatograms of positive wet tissue samplesA：wet tissue containing benzethonium chloride and cetylpyridinium chloride；B：wet tissue containing methyl 4-hydroxybenzoate

3 結(jié) 論

本文通過對色譜分析條件和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，建立了同時(shí)測定生活用紙及紙制品中19種有機(jī)抗菌劑（包括7種氯苯酚類化合物、6種季銨鹽類化合物和6種對羥基苯甲酸酯類化合物）含量的高效液相色譜法，方法檢出限為0．05～0．3 mg/kg；樣品加標(biāo)回收率為74．8%～101%，RSD為2．2%～5．6%。該方法簡單、快速、準(zhǔn)確可靠，適用于生活用紙及紙制品中19種有機(jī)抗菌劑的同時(shí)檢測。