氣相色譜－串聯質譜法測定電子煙煙液中的10種生物堿含量

嚴 俊，王紅娟，陳志燕，陳 歡，周 蕓，羅彥波，范 忠，付亞寧，鄧賓玲，劉 彤，韋入丹，黃世杰，韓書磊*

（1．廣西中煙工業有限責任公司，廣西 南寧 530001；2．國家煙草質量監督檢驗中心，河南 鄭州 450001）

電子煙通過內置霧化器將煙液霧化供人吸食，一般由霧化器、電池、煙液、傳感器等部分組成［1－3］。電子煙煙液一般含有霧化劑（如1，2-丙二醇、丙三醇）、各種調味添加劑、煙堿（尼古丁）等［4－7］。煙堿是電子煙煙液的重要物質和標簽，含量一般為0～36 mg/g［4，8］，是人們消費電子煙的重要原因之一，國外多個電子煙法規或標準均限定了電子煙煙液中的煙堿含量［9－12］。電子煙煙液中的煙堿一般來源于煙草提取，而降煙堿、假木賊堿、新煙草堿、麥斯明、β-二烯煙堿、可替寧、2，3’-聯吡啶等是煙草中的主要次要生物堿，均與煙堿具有類似的結構和化學特性，在煙堿的提取和純化過程中往往難以完全去除，是影響煙堿感官及生理效應的重要因素，并可能作為判別煙堿來源的“指紋圖譜”［7－8］。因此，電子煙煙液中生物堿的檢測具有重要意義。

目前，電子煙煙液中生物堿的分析報道相對較少，測定方法主要有氣相色譜法（GC/FID）［4，13］、氣相色譜－質譜法（GC－MS）［14］、液相色譜法（HPLC/UV）［7，15］、液相色譜－串聯質譜法（HPLC－MS/MS）［16］等。由于電子煙煙液基質復雜，可能含有多種添加劑和香味物質［17］，GC/FID和HPLC/UV僅使用保留時間定性，易出現假陽性結果，GC－MS雖快速、靈敏度高，但其抗基質干擾能力有限，而HPLC－MS/MS儀器昂貴，普及率相對較低。基于此，本文建立了一種液－液萃取/氣相色譜－串聯質譜法（LLE/GC－MS/MS）測定電子煙煙液中10種生物堿含量的分析方法，方法具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好等優點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜－三重四極桿質譜聯用儀（2010－plus氣相色譜儀，配TQ 8030三重四極桿質譜儀，日本島津公司）；AE163電子天平（感量：0．000 1 g，瑞士Mettler公司）；Talboys數顯型多管式旋渦混合器；電子煙煙液為市售樣品。

降煙堿（純度98%，美國Alfa Aesar公司）；煙堿、N-甲基假木賊堿、麥斯明、假木賊堿、β-二烯煙堿、新煙草堿、2，3’-聯吡啶、β-二烯降煙堿、可替寧（純度>97%，加拿大Toronto Research Chemicals公司）；內標物：喹啉（純度98%，美國Alfa Aesar公司），降煙堿-2，4，5，6-D4（降煙堿-D4，純度98%，加拿大CDN Isotopes公司），2，2’-聯吡啶-D8（純度98%，加拿大CDN Isotopes）；甲醇、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷（色譜純，韓國Duksan公司）；氫氧化鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。實驗用水為Milli-Q系統（Milford，MA，USA）制備的超純水。

1.2 標準工作溶液配制

內標儲備液的配制：用甲醇配制喹啉、降煙堿-D4、2，2’-聯吡啶-D8質量濃度分別為50、1．0、1．0 mg/mL的內標儲備液。

標準儲備液的配制：用甲醇分別配制煙堿、降煙堿和其他8種次要生物堿質量濃度分別為50、2．0、2．0 mg/mL的標準儲備液。

標準工作溶液的配制：用二氯甲烷將標準儲備液逐級稀釋，配制煙堿質量濃度分別為0．025、0．05、0．10、0．50、1．0 mg/mL的標準工作溶液，內標（喹啉）質量濃度為0．25 mg/mL，配制其他9種次要生物堿質量濃度分別為0．002 5、0．01、0．05、0．25、1．0、5．0、20．0μg/mL的標準工作溶液，內標（降煙堿-D4和2，2’-聯吡啶-D8）質量濃度為5．0μg/mL，其中，喹啉為煙堿內標，降煙堿-D4為降煙堿內標，2，2’-聯吡啶-D8為其他8種次要生物堿內標。

1.3 樣品前處理

準確稱取0．3 g電子煙煙液樣品于15 mL塑料離心管中，再分別加入50μL內標溶液和2．0 mL 2%NaOH水溶液，混勻靜置10 min后，加入10 mL二氯甲烷－甲醇溶液（體積比4∶1），加蓋密封后置于渦旋振蕩器中以2 000 r/min渦旋振蕩提取30 min。室溫靜置1 h后，取下層有機相以無水硫酸鎂干燥除水，轉移至色譜分析瓶中，待GC－MS/MS分析。

1.4 色譜－質譜條件

1.4.1 色譜條件 DB－35MS毛細管色譜柱（30 m×0．25 mm×0．25μm）；進樣口溫度：250℃；進樣量：1μL；載氣：氦氣（純度≥99．999%），恒流模式，流速：1．0 mL/min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1 min，以20℃/min升至200℃，再以50℃/min升至300℃，保持5 min；煙堿和9種次要生物堿采用兩次進樣，其中，煙堿分流比為100∶1，9種次要生物堿分流比為10∶1，煙堿溶劑延遲為5 min，其他次要生物堿溶劑延遲為7 min。

1.4.2 質譜條件 電離方式：電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃；碰撞氣：氬氣，碰撞氣壓力200 kPa；質譜掃描方式：多反應監測模式（MRM），監測參數見表1。

表1 目標物和內標的保留時間和MRM參數Table 1 Retention time and parameters of MRM mode for target analytes and intemal standards

2 結果與討論

2.1 色譜－質譜條件優化

采用中等極性的DB－35MS毛細管色譜柱為分析柱，在全掃描（Full scan）模式下，通過優化升溫程序，在15 min內實現了10種目標物和3種內標物的基線分離，并通過單標溶液對目標化合物進行確認。將一定質量濃度的混合標準工作溶液進行一級質譜全掃描，選擇特征明顯、質量數高、重現性好的離子作為目標物和內標物的母離子，然后采用產物離子掃描模式優化碰撞能量及產物子離子，對每組母離子/子離子分別選擇碰撞能量為1～50 eV進行掃描，間隔3 eV，選擇離子對響應最強的碰撞能量，最終確定目標物和內標物的母離子、子離子、碰撞能量、定量/定性離子豐度比等參數，并以豐度最高的子離子進行定量分析，豐度次高的離子對進行定性分析，目標物和內標的MRM參數優化結果如表1所示，優化條件下10種目標物和3種內標物的色譜圖見圖1。

圖1 多反應監測模式下標準工作溶液中目標物色譜圖Fig．1 Chromatograms of target analytes in standard solution under multiple monitor mode（MRM）the peak numbers（1-10 and IS）were the same as those in Table 1

2.2 萃取溶劑的選擇

電子煙煙液一般為弱酸性或弱堿性［18］，生物堿是一種含氮雜環有機堿性物質，在酸性條件下具有水溶性，而在堿性條件下為脂溶性，因此，氣相色譜分析時需加入適量堿性水溶液將生物堿游離出來，再加入有機溶劑進行液－液萃取。以加入有生物堿混合標準溶液的1，2-丙二醇和丙三醇混合溶劑（質量比為1∶1）為研究對象，參考文獻報道的常用生物堿萃取溶劑［19－22］，比較了正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷5種溶劑的萃取效率。結果發現，正己烷對大部分次要生物堿的萃取效率均較低，甲基叔丁基醚對β-二烯煙堿及可替寧的萃取效率較低，乙酸乙酯對可替寧的萃取效率不高，三氯甲烷對降煙堿、假木賊堿及新煙草堿的萃取效率均很低，可能是目標化合物發生了分解或反應生成其他物質，二氯甲烷對所有目標化合物的綜合萃取效率最高（92．0%～100%）。根據文獻報道［22－23］，由于甲醇在水及二氯甲烷中均具有一定溶解度，向二氯甲烷中加入適量甲醇可提高對生物堿的萃取效率，因此比較了不同比例二氯甲烷－甲醇（體積比1∶0、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1）對生物堿萃取效率的影響，發現當加入甲醇后，二氯甲烷的萃取效率略有提高，當二氯甲烷與甲醇體積比為4∶1時對生物堿的綜合萃取效率最高（96．9%～100%），所以最終選擇二氯甲烷-甲醇（體積比4∶1）為萃取溶劑。

2.3 NaOH含量的選擇

由于需加入一定量堿性溶劑才能夠將電子煙煙液中結合態的生物堿游離出來，從而提高萃取效率，已有文獻報道煙草及卷煙主流煙氣中生物堿測定多采用1%～8%的氫氧化鈉（NaOH）溶液［20，23－25］。因此實驗考察了添加2．0 mL不同含量（0．5%、1%、2%、5%、10%）NaOH對回收率的影響。結果顯示，不同含量NaOH溶液對回收率（82．3%～100%）的影響不明顯，2%～10%的NaOH萃取效率略高于0．5%和1%，因此最終選擇2%的NaOH溶液（回收率為91．0%～98．7%），既可滿足回收率的要求，又可避免高濃度NaOH可能導致的乳化現象。

2.4 提取方式及萃取時間的選擇

實驗考察了超聲提取、機械振蕩、渦旋振蕩3種提取方式對回收率的影響。結果發現，超聲振蕩的效果略差，而機械振蕩提取和渦旋振蕩提取的回收率差異不明顯，考慮到前處理過程的便捷性，最終選擇渦旋振蕩提取，并對渦旋振蕩時間（10、20、30、40、50、60 min）進行了考察，發現渦旋30 min后目標物已基本萃取完全，因此最終選擇渦旋振蕩萃取30 min。

2.5 目標物在萃取溶液中的穩定性

萃取溶液中的生物堿可能在光、熱等作用下發生氧化反應而影響測試結果的準確性［26］。為考察目標物在萃取溶液中的穩定性，將萃取溶液裝入色譜瓶中，考察在室溫（約20℃）下放置（0～120 h）對測定結果的影響。結果發現，隨著放置時間的延長，萃取溶液中的目標化合物含量未發生明顯變化，表明目標化合物在萃取溶液中具有較好的穩定性。

2.6 GC－MS/MS與GC－MS方法的比較

電子煙煙液可能存在數百種添加劑和香味物質，這些物質可能對次要生物堿等痕量化合物的測定造成干擾［27］。相比GC－MS，GC－MS/MS儀器價格相對較高，普及率相對較低，但測定準確性更好。因此，在相同樣品前處理條件下，對比了GC－MS/MS與GC－MS兩種儀器分析方法的測試結果。結果顯示：①兩種方法測試結果的相對標準偏差不高于12%（表2），表明兩種方法的一致性良好；②GCMS在分析部分水果口味樣品時部分次要生物堿（如假木賊堿）和內標（降煙堿-D4）均存在明顯的基質干擾現象，嚴重影響了目標物的定性定量分析，而GC－MS/MS因采用二級離子定性定量，解決了雜質碎片離子的干擾問題，提高了分析的準確性；③在靈敏度方面，與GC－MS相比，除個別目標物外（如降煙堿、假木賊堿），GC－MS/MS方法的檢出限均低于或顯著低于GC－MS（表2），顯示了更高的靈敏度。綜上所述，與GC－MS相比，GC－MS/MS更適合電子煙煙液中生物堿的測定。

表2 GC－MS/MS與GC－MS方法的比較Table 2 Comparison of GC－MS/MS and GC－MS

2.7 方法學評價

在優化條件下，對10種目標物的系列標準工作溶液進行分析，內標法定量，以各目標物與內標物定量離子峰面積的比值（y）為縱坐標，對應目標物質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。并取陰性空白樣品為基質進行低、中、高3個水平的加標回收實驗，每個加標水平重復測定5次，以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限。結果顯示：煙堿及9種次要生物堿分別在25～1 000μg/mL及0．002 5～20μg/mL范圍內呈良好的線性，相關系數（r2）不低于0．997 1，檢出限（LOD）為0．0040～0．10 mg/kg，定量下限（LOQ，S/N=10）為0．013～0．33 mg/kg，10種化合物在3個加標水平下的回收率為87．9%～109%，日內及日間相對標準偏差（RSD）分別不大于6．8%和7．9%。

表3 10種生物堿的線性范圍、相關系數、回收率、精密度、檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges，correlation coeffinients（r2），spiked recoveries，RSDs，LODs and LOQs of target analytes

2.8 實際樣品分析

利用本方法對23種品牌共計171種型號電子煙煙液中的10種生物堿進行了測定（典型樣品色譜圖如圖2所示）。結果顯示，電子煙煙液中煙堿含量為2．16～23．73 mg/g，與文獻報道的范圍相一致［4，7］。電子煙煙液中9種次要生物堿的檢出率為64．91%～99．42%，含量中位值為0．06～7．35 mg/kg，遠低于傳統煙草［21］，這是由于電子煙煙液中的煙堿來源于煙草，在提取和純化過程中次要生物堿會被逐級去除。此外，有9種電子煙煙液樣品的總次要生物堿含量與煙堿含量比例大于1．0%，最高可達4．3%，超出了美國等國家或地區對藥典級煙堿純度的限量要求（1．0%）［12］，表明應對電子煙煙液中煙堿純度作進一步規范。

圖2 多反應監測模式下樣品溶液中目標物色譜圖Fig．2 Chromatograms of target analytes in sample solution under multiple monitor mode（MRM）the peak number（1-10 and IS）as those in Table 1

3 結 論

本研究通過優化色譜－質譜條件及樣品前處理條件，以2%NaOH溶液為堿性溶液，以10 mL二氯甲烷－甲醇溶液（體積比4∶1）為萃取溶液，建立了一種液-液萃取/氣相色譜－串聯質譜法測定電子煙煙液中的10種生物堿含量的分析方法，方法靈敏度高，抗干擾能力強，適合電子煙煙液樣品中10種生物堿含量的測定。