乳酸通過GPR81介導的Nrf2／LDHA通路促進非小細胞肺癌H1299細胞的遷移

曹玉祥，張志堅，周辰康，魏慧君，吳志浩*

（1.皖南醫(yī)學院檢驗學院，安徽 蕪湖 241002；2.基礎醫(yī)學院；3.安徽省活性大分子研究重點實驗室）

肺癌是全球發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤，目前5年相對生存率僅為15%［1］，是一種以細胞異常增殖為特點的疾病之一，造成肺癌患者遠期生存率較低的主要原因是腫瘤的侵襲和轉移。全球80%以上的肺癌死亡病例是由非小細胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）轉移引起的［2］。NSCLC在肺癌中最常見，其發(fā)生、發(fā)展機制一直是腫瘤學研究的熱點。

G蛋白偶聯受體81（G protein－coupled receptor 81，GPR81）被鑒定為乳酸的受體［3］，其在脂肪細胞和骨骼肌細胞中高表達，目前發(fā)現在包括肺癌細胞在內的多種腫瘤細胞中同樣高水平表達［4］，有研究強調了GPR81在腫瘤生長和遷移過程中的重要性，在乳腺癌中高表達的GPR81以PI3K／Akt途徑依賴的方式促進增殖并刺激血管生成［5］。Roland等［6］的研究表明GPR81表達水平與胰腺癌腫瘤生長速度相關，抑制GPR81表達可顯著降低腫瘤生長和體內轉移。在我們的前期研究中發(fā)現GPR81可以介導肺癌細胞的侵襲遷移和免疫逃逸［7－8］。

核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2－related factor 2，Nrf2）是一種細胞存活的調節(jié)因子并可以啟動細胞防御機制，在氧化應激和外源性應激條件下，能引起Nrf2對細胞的保護作用［9］，防止腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而Nrf2不僅可以保護正常細胞，在腫瘤細胞中表達量較正常細胞高，維持腫瘤細胞的氧化還原平衡狀態(tài)，在保護腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等過程中扮演著重要角色，但 其 分 子 機 制 并 不 清 楚［10］。乳 酸 脫 氫 酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）是糖酵解途徑中的關鍵酶之一，對丙酮酸具有較強的親和力，LDHA的表達又會促進糖醇解產生大量乳酸［11］。本文探究GPR81介導的乳酸通過Nrf2／LDHA通路促進NSCLC遷移的信號通路，并探索其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 NSCLC細胞系H1299由上海生科院細胞庫提供；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；10%小牛血清購自南京博全科技有限公司；基因組DNA提取試劑盒、DNA marker、2×Taq PCR MasterMix購自北京天根生化科技有限公司；DNA上樣緩沖液、感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠、2×Leammli Sample Buffer細胞裂解液、抗β－actin抗體購自美國Sigma公司；PCR純化試劑盒、質粒大量提取試劑盒購自德國Qiagen公司；限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ，T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司；質粒小量抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PolyJet轉染試劑購自美國SignaGen公司；pGL3－Basic載體、pRL－CMV載體、Passive Lysis Buffer細胞裂解液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Promega公司；Nrf2質粒購自美國Addgene公司；siLDHA、siNrf2購自廣州銳博生物科技有限公司；紫外分光光度計、PCR儀購自德國Eppendorf公司；凝膠成像儀購自美國Protein Simple公司；抗Nrf2抗體購自英國Abcam公司；抗LDHA抗體購自美國CST公司；Amersham Imager 600成像儀購自美國GE公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)H1299細胞，培養(yǎng)基中含青霉素、鏈霉素100 U／ml。

1.3 細胞轉染 取對數生長期的H1299細胞，于轉染前1 d接種到6孔板（105個／孔）或者12孔板（5×104個／孔）中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到30%～50%時進行轉染，根據Lipofectamine 2000說明書，將siRNA轉入細胞中，在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h后，用于相關檢測實驗。

1.4 Western blot檢測蛋白表達水平 將已處理完成的細胞使用PBS洗滌，加入細胞裂解液，迅速將細胞刮下收集細胞。100℃熱變性5 min，使用10% SDS－PAGE電泳后電轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，5%牛奶室溫封閉1 h，按照1∶1 000比例稀釋并孵育一抗，4℃過夜，按照1∶2 000比例稀釋并室溫孵育二抗1 h，ECL發(fā)光顯影。使用Amersham Imager 600系統對目的條帶進行成像分析，測定灰度值，用β－actin作為內參對照，來檢測相關蛋白的相對表達量。

1.5 質粒構建 用DNA提取試劑盒提取細胞基因組DNA，根據UCSC Genome Browser數據庫中Genomic Sequence報道的人源LDHA基因啟動子序列（NR－028500.1）利用oligo 7軟件設計單鏈引物，并在上游引物和下游引物中分別添加KpnⅠ和HindⅢ兩種酶切位點，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：LDHA－luc（238 bp）上游引物：5′－GGGGTACC ACGTGGAGCAGTCTGCCGGTCGGTTG－3′（下 劃 線 部 分 為KpnⅠ酶切位點），下游引物：5′－GGGAAGCTT TCG TCGGGGGCGCGTGGCAATGAGAT－3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）；LDHA－luc（1 249 bp）上游 引 物：5′－GGGGTACC GGCAATGGAATCAGCAAGAATACAGG－3′（下劃線部分為KpnⅠ酶切位點），下游引物：5′－GGGAAGCTT TCGTCGGGGGC GCGTGGCAATGAGAT－3′（下劃線部分為HindⅢ酶切位點）。經擴增、酶切、連接、測序，完成質粒構建。

1.6 雙熒光素酶活性測定 LDHA－luc是由LDHA基因啟動子控制的表達螢火蟲熒光素酶的質粒，pRL－CMV是由CMV啟動子控制的表達海腎熒光素酶的質粒（作為轉染效率的對照）。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，棄去孔內培養(yǎng)基，使用PBS洗滌2次，每孔加入Passive Lysis Buffer裂解液100 μl，室溫搖動20 min后收取樣品，4℃離心15 min進行檢測。取20 μl上清液與20 μl Luciferase Assay Buffer混合，檢測螢火蟲熒光素酶的活性；繼續(xù)加入20 μl Stop＆Glo Buffer混合，檢測海腎熒光素酶活性，計算2種熒光素酶活性的比值。

1.7 細胞遷移劃痕實驗 在H1299細胞中分別共轉染Nrf2＋control siRNA、Nrf2＋LDHA siRNA，以pcDNA3.1＋control siRNA作為對照。48 h后，用無血清培養(yǎng)基同步化處理，用無菌的10 μl槍頭對細胞進行劃痕實驗，PBS清洗2次后換上無血清培養(yǎng)基并一直使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，立即使用熒光倒置顯微鏡進行拍照，記為0 h，每隔24 h拍一次照，分別記為24、48、72、96 h。實驗重復3次，重復照相，并計算平均值。

1.8 Transwell實驗 將0 mmol／L和20 mmol／L乳酸處理過的細胞經胰酶消化后調整濃度為1×105個／ml，700 μl含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入Transwell下室，300 μl細胞懸浮液加入Transwell上室，在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，吸去廢液，用棉簽擦凈基底膜，PBS清洗，甲醛固定10 min，結晶紫染色20 min，清水漂洗，顯微鏡下觀察、拍照并計數。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析作圖，計量資料采用均數±標準差表示，2組均數的比較采用t檢驗；多組均數的比較采用方差分析，組間比較采用Dunnet t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義；細胞遷移劃痕實驗采用Image－Pro Plus 6.0軟件分析細胞的平均遷移速率。

2 結果

2.1 乳酸促進H1299細胞的遷移及相關蛋白水平的上升 Transwell實驗結果顯示，利用20 mmol／L乳酸處理過的H1299細胞穿膜比例明顯高于未處理過的細胞，是對照組10倍，差異有統計學意義（P＜0.05） （圖1A、圖1B）；Western blot結果顯示，不同濃度乳酸處理H1299細胞，GPR81、Nrf2和LDHA蛋白表達水平隨著乳酸濃度的遞增而成上升趨勢（圖1C、圖1D）。

圖1 乳酸促進H1299細胞的遷移及相關蛋白水平的上升

2.2 GPR81介導乳酸對Nrf2／LDHA通路的上調

Western blot結果顯示，在H1299細胞中轉染GPR81 siRNA，Nrf2和LDHA的蛋白表達水平明顯下降，同時也觀察到p－AKT蛋白水平的降低（圖2A、圖2B）；當在H1299細胞中加入PI3K－AKT通路抑制劑LY294002時，p－AKT蛋白水平降低，Nrf2和LDHA蛋白表達水平隨之降低（圖2C、圖2D）。

圖2 GPR81介導乳酸對Nrf2／LDHA通路的上調

2.3 Nrf2對LDHA促進作用的分子機制 Western blot結果顯示，在H1299細胞中轉染Nrf2 siRNA，不同濃度乳酸處理，LDHA蛋白表達水平降低，并隨著乳酸濃度的遞增而成上升趨勢（圖3A、圖3B）；構建完成不同片段長度的LDHA啟動子質粒LDHA－luc（1 249 bp）和LDHA－luc（238 bp）（圖3C、圖3D）；在H1299細胞中轉染pcDNA3.1＋LDHA－luc（238 bp）、Nrf2＋LDHA－luc（238 bp）、pcDNA3.1＋LDHA－luc（1 249 bp）和Nrf2＋LDHA－luc（1 249 bp），與對照組相比，Nrf2對LDHA啟動子活性有促進作用，并且LDHA－luc（1 249 bp）活性比LDHA－luc（238 bp）活性高（圖3E）。

圖3 Nrf2對LDHA促進作用的分子機制

2.4 LDHA的表達影響H1299細胞的遷移速率細胞遷移劃痕實驗結果顯示，在H1299細胞中轉染Nrf2＋LDHA siRNA實驗組的遷移速率明顯比轉染Nrf2＋control siRNA實驗組的遷移速率慢（圖4A）；且在96 h內的平均遷移速率分別為（15.4±0.5）μm／d、 （38.7±0.5）μm／d和（19.0±0.5）μm／d（圖4B）。

圖4 LDHA的表達影響H1299細胞的遷移速率

3 討論

肺癌侵襲轉移的動態(tài)過程是多因素、多環(huán)節(jié)、連續(xù)漸進的，涉及到多個基因的突變和功能變化，引起許多信號通路功能的異常，進而引發(fā)有助于腫瘤生長的生物學效應［12］。有研究顯示，腫瘤細胞的侵襲遷移與腫瘤微環(huán)境中乳酸的不斷積累有密切聯系［13］。有氧糖酵解是由腫瘤細胞內基因突變而誘發(fā)的代謝重編程，即在氧氣充足條件下，將丙酮酸轉化為乳酸，而不是進入三羧酸循環(huán)［14］，其主要功能是使糖酵解產物通過旁路途徑合成核酸、蛋白質及脂肪酸的前體［15］，從而滿足腫瘤生長的需要，在腫瘤細胞遷移過程中起了關鍵作用。Nrf2作為對氧化還原敏感的核轉錄因子，在受到氧化劑等物質刺激時，會由細胞質轉移到細胞核中，啟動ARE調控氧化應激蛋白和多種Ⅱ相解毒酶基因轉錄［16］。從而探索Nrf2對LDHA的誘導為進一步探索腫瘤代謝和微環(huán)境對癌細胞生長的影響做出了鋪墊。

在高濃度的乳酸環(huán)境中，乳酸水平的穩(wěn)定是靠單羧酸轉運蛋白（MCTs）來調控。在體外模擬腫瘤微環(huán)境，當用乳酸作為癌細胞的主要能源時，GPR81表型缺失的癌細胞，對乳酸水平變化不敏感，線粒體活性受到抑制，細胞的生長和增殖受到影響，而正常的癌細胞中，MCTs和過氧化物酶體增殖物激活受體－γ共激活因子－1α（PGC－1α）的水平相應增加［6］，因此，GPR81在癌細胞的生存中起重要作用。本文將GPR81作為乳酸介導Nrf2／LDHA信號通路的關鍵因素進行探索研究，并進行了證明。

綜上所述，本研究通過乳酸對H1299細胞遷移的影響，探索了核轉錄因子Nrf2對LDHA促進作用的分子機制，進而明確了乳酸通過GPR81調控Nrf2／LDHA的信號通路，為后期臨床癌細胞侵襲遷移的相關研究奠定了基礎。