一種豬肺炎支原體陽(yáng)性血清的制備方法

黃玉婷 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬支原體肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的豬的一種接觸性呼吸系統(tǒng)傳染病，在我國(guó)也稱(chēng)為豬喘氣病。該病發(fā)病率高、病死率低，但由于其流行的廣泛性、長(zhǎng)期性、消耗性，常常降低豬只的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

目前，疫苗免疫接種是預(yù)防和凈化豬支原體肺炎最經(jīng)濟(jì)有效的手段[2]。根據(jù)《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版生物制品卷規(guī)定，豬支原體肺炎活疫苗必須進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)，該項(xiàng)檢驗(yàn)需用抗Mhp特異性血清（AGP效價(jià)≥1:8）對(duì)樣品進(jìn)行中和。本研究以兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，建立豬肺炎支原體陽(yáng)性血清制備方法，不但成本相較于豬低，同時(shí)降低了同源動(dòng)物其它外源病毒的污染風(fēng)險(xiǎn)，為豬肺炎支原體研究、診斷、鑒別等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 體重1.5～3.0 kg新西蘭兔，購(gòu)自上海市松聯(lián)試驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)。

1.1.2 豬肺炎支原體（168株）抗原 由兆豐華生物科技（福州）有限公司生產(chǎn)，效價(jià)為109CCU/mL。

1.1.3 豬支原體肺炎活疫苗（168株） 由兆豐華生物科技 （福州）有限公司生產(chǎn)，效價(jià)為108CCU/頭份。

1.1.4 豬鼻支原體（CVCC361） 購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 方法

1.2.1 滅活疫苗制備 將豬肺炎支原體（168株）抗原用滅活劑進(jìn)行滅活后乳化，制備豬支原體肺炎滅活疫苗，分裝備用。

1.2.2 動(dòng)物篩選 挑選體重1.5～3.0 kg大兔，按照表1中列出的檢測(cè)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒等相關(guān)抗原抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 動(dòng)物免疫 按表1方法，挑選3只符合要求且生長(zhǎng)狀況接近的健康雄性大兔，按表2方法進(jìn)行免疫接種，當(dāng)達(dá)到效價(jià)后收獲血清。

表1 動(dòng)物篩選檢測(cè)項(xiàng)目

表2 豬肺炎支原體陽(yáng)性血清免疫程序

1.2.4 血清的采集與分離 四免后每周采集兔血清并監(jiān)測(cè)抗體水平，當(dāng)抗體水平達(dá)到要求時(shí)，用無(wú)菌心臟采血法收獲并分離血清。

1.2.5 分裝保存 將混合均勻的血清進(jìn)行無(wú)菌分裝，并放置于-20℃以下保存。

1.2.6 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 稱(chēng)取一定量瓊脂粉，按1%比例加入8%生理鹽水熱溶，將融化的瓊脂倒入直徑9 cm平板，每塊平板25 mL左右，待瓊脂冷卻后用直徑3 mm梅花形打孔器打孔，酒精燈封底。吸取2倍稀釋的肺炎支原體抗原至中間孔，所制備的陽(yáng)性血清按2倍系列稀釋加樣。加樣后，將瓊脂平板倒置放入濕盒，于37℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.7 物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn) 按《中國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行檢測(cè)[3]。

1.2.8 豬常見(jiàn)病原檢測(cè) 按表1方法對(duì)豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒等相關(guān)抗原抗體進(jìn)行檢測(cè)。并將豬鼻支原體抗原與所制備的陽(yáng)性血清進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，觀察抗原孔與陽(yáng)性血清孔之間是否有沉淀產(chǎn)生。

1.2.9 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定 按《中國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行檢測(cè)[4]。

1.2.10 鑒別檢驗(yàn) 將豬支原體肺炎活疫苗（168株）做10倍系列稀釋至10-4CCU/mL，與等量所制備的陽(yáng)性血清混合，在37℃水浴中和2 h，取0.2 mL接種至1.8 mL液體KM2培養(yǎng)基，培養(yǎng)、觀察15 d。同時(shí)設(shè)豬肺炎支原體陰性血清中和對(duì)照組、培養(yǎng)基對(duì)照組、病毒對(duì)照組，觀察培養(yǎng)基變色情況。

1.2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 公司不同試驗(yàn)人員做對(duì)比試驗(yàn)，按本試驗(yàn)方法挑選3只符合要求且生長(zhǎng)狀況接近的健康雄性大兔，由3名試驗(yàn)人員做一次重復(fù)試驗(yàn)，并在四免后21 d采血收獲，測(cè)定瓊擴(kuò)效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法測(cè)定血清抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。血清瓊擴(kuò)效價(jià)隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì)，且在四免后21 d效價(jià)可以達(dá)到1:16以上，可以收獲全部血清。

表3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法測(cè)定抗體效價(jià)結(jié)果

2.2 物理性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn) 從血清中隨機(jī)抽取5支按《中國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行物理性狀檢驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)，物理性狀均符合要求，均無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)支原體生長(zhǎng)，且無(wú)外源病毒污染，檢驗(yàn)合格。

2.3 豬常見(jiàn)病原檢測(cè) 按表1方法進(jìn)行檢測(cè)，豬肺炎支原體（Mhp）抗體結(jié)果為陽(yáng)性，其余結(jié)果均為陰性。所獲血清與豬鼻支原體抗原的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果無(wú)沉淀線產(chǎn)生，說(shuō)明血清中無(wú)豬鼻支原體抗體。結(jié)果符合預(yù)期。

2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定 按《中國(guó)獸藥典》方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定，每毫升血清的內(nèi)毒素含量低于10 EU，符合規(guī)定。

2.5 鑒別檢驗(yàn) 陽(yáng)性血清中和組、培養(yǎng)基對(duì)照組均未變色，陰性血清中和對(duì)照組、病毒對(duì)照組培養(yǎng)基均變色，結(jié)果符合預(yù)期。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)均≥1:16，說(shuō)明本試驗(yàn)具有可重復(fù)性。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)效價(jià)測(cè)定結(jié)果

3 討論

1）本研究以兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，相較于豬成本大大降低，同時(shí)規(guī)避了同源動(dòng)物其它外源病毒的污染風(fēng)險(xiǎn)；相較于鼠則在免疫、采血等操作中的便捷性、降低死亡率、提高血清獲取量等方面有著較大優(yōu)勢(shì)。

2）通過(guò)無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)定、豬常見(jiàn)病原的抗原抗體檢測(cè)，保證了所獲得陽(yáng)性血清的純凈性和特異性。通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)證明本研究可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好。

3）本研究操作簡(jiǎn)便，成本較低，制備的陽(yáng)性血清具有良好的特異性和抗體效價(jià)，能夠滿(mǎn)足對(duì)豬肺炎支原體的研究、診斷、鑒別等相關(guān)需求。