一例豬流行性腹瀉病毒變異株引起仔豬腹瀉的診斷

華 珍 武夷山市農業農村局 福建武夷山 354300

近來年，國內豬場對豬病的防控意識逐漸提高，但仔豬腹瀉仍是威脅我國生豬養殖發展的主要疾病之一，且每年因仔豬腹瀉死亡所造成的經濟損失巨大。在生豬飼養中，引起仔豬腹瀉的病毒性病原種類繁多，包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德塔冠狀病毒（PDcoV）和豬輪狀病毒（PRoV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒（PCV）和豬細小病毒（PPV）等，以上病原感染仔豬所導致的臨床癥狀及病理變化較為相似，使用傳統臨床診斷方法無法確診，繼而延誤疾病防治[1]。隨著分子生物學技術的快速發展，以PCR/RT-PCR技術為核心的檢測方法廣泛應用于豬場病原的快速診斷，這為疾病的防控提供了便捷的技術手段。

2020年11月初，福建省南平地區某養殖場仔豬暴發腹瀉，筆者根據發病仔豬臨床癥狀特點，采集其小腸組織樣品進行實驗室檢查，結果該場暴發的腹瀉是由PEDV變異株引起，現將具體診斷過程報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例情況 福建南平某豬場飼養繁殖母豬40余頭，該場于2020年11月初，部分欄舍仔豬開始腹瀉，其后豬場飼養員給腹瀉仔豬灌服抗生素，但效果不佳。至11月7日，該場已有80余頭仔豬發病，死亡42頭。據養殖戶介紹，發病豬群典型臨床癥狀即為急性腹瀉，且部分仔豬嘔吐，導致患豬死亡的大部分原因是嚴重脫水。為確診，采集發病嚴重的仔豬小腸、腹股溝淋巴結送至生豬疫病檢測中心進行病原診斷。

1.2 主要材料 DNA/RNA核酸提取試劑盒購自北京生化科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自伯樂生命醫學產品有限公司；Taq PCR Mix預混液、DL 2000 marker和瓊脂糖粉末等均購自于上海生物工程科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病料處理與核酸提取 用滅菌刀將小腸和淋巴結組織切碎后，取0.2 g組織與1 mL生理鹽水混合，高速勻漿后離心，取200 uL上清根據DNA/RNA提取試劑盒說明書提取樣本核酸，將核酸中RNA反轉錄為cDNA，將cDNA樣品保存于-80℃待檢。

1.3.2 病原檢測 應用商業化病原檢測試劑盒采用實時熒光定量PCR法分別檢測樣品中是否含有PEDV、TGEV、PRoV、PDcoV、PRV、PPV和PCV2，根據樣品CT值判定其是否為對應病原陰、陽性。

1.3.3 PEDV S1基因序列擴增及分析 用一對特異性引物擴增PEDV S1基因序列，其中RT-PCR體系（50 uL）中包含2×PCR mix預混液25 uL、上下游引物（10 pmoL/L）各2 uL、模板cDNA 3 uL及雙蒸水18 uL，反應條件為94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，共35個循環，72℃10 min，其后將PCR產物進行凝膠電泳，并切膠回收后送至生物公司進行雙向測序。將返回序列進行拼接后，在NCBI網站上進行BLAST，比較該序列與GenBank上收錄的不同PEDV毒株對應序列的同源性，確定獲得毒株所屬的基因型。

2 結 果

2.1 病原檢測結果 使用商業化試劑盒分別檢測可能導致仔豬腹瀉的病毒性病原，結果僅從發病豬組織樣品中檢測出PEDV核酸。此外，我們對樣品處理后接種在普通瓊脂培養基培養，未發現任何菌落生長，提示該場仔豬腹瀉是由PEDV感染引起。

2.2 PEDV S1基因擴增凝膠電泳結果 使用一對特異性引物應用PCR法擴增PEDV S1基因序列，將PCR產物進行凝膠電泳，結果見圖1，擴增序列大小約為1900 bp左右，與預期大小基本一致，且無非特異性條帶，提示擴增的PCR產物為PEDV S1基因序列。

圖1 PEDV S1基因序列擴增PCR產物凝膠電泳圖

2.3 PEDV S1基因序列變異情況分析 將PCR陽性產物進行純化后送至生物公司進行雙向測序，對返回序列進行拼接，最終序列大小為1983 bp。核苷酸序列同源性分析結果（見圖2）發現，該毒株S1基因序列與GenBank收錄的PEDV中國流行變異株（KY624222.1和KY624212.1）同源性較高，均超過97.4%，但與PEDV疫苗株（JN599150.1）同源性相對較低，僅為92.2%。根據以上結果可判定該場此次暴發的腹瀉是由PEDV變異株引起。

圖2 PEDV分離株S1基因核苷酸序列同源性分析結果

3 討論

1）近年來，很多養殖場極大程度地提高了生物安全防控水平，這對疫病防控起到了積極作用。但仔豬腹瀉在豬場仍然較為常見，且導致仔豬腹瀉的病原較多，使用傳統的臨床診斷方法無法對此類病原進行準確診斷，需依靠更加方便快捷的分子生物學方法。

2）PEDV在我國是導致仔豬腹瀉的主要病原之一，該病原為RNA病毒，屬冠狀病毒科，其基因組變異速率較快，給相應的防控帶來巨大考驗。在2010年后我國出現了PEDV變異株，與傳統毒株相比，變異株毒力更強，對我國養豬業危害也更大。在PEDV基因組中，S1基因變異速率相對較快，選擇以S1基因序列進行遺傳進化分析可初步明確毒株基因型和變異情況[2-3]。

3）該文涉及到的案例為仔豬嚴重腹瀉，但傳統的臨床診斷無法對病原進行確診，筆者采用分子生物學方法，最終確定為PEDV感染。由于PEDV分為疫苗株和變異株，這兩種毒株均可導致仔豬腹瀉，但基于疫苗株研發的疫苗對變異株的防控能力有限，故筆者通過擴增與分析該毒株的S1基因變異情況，確定該毒株屬于變異株。對于豬流行性腹瀉的防控，養殖場可以按生物防控和疫苗接種模式進行，其中生物防控包括定期消毒、減少飼養人員在豬舍間流動，同時提高飼養管理水平等；而疫苗接種主要是對豬群免疫接種PEDV相應的弱毒苗或滅活疫苗。