布魯氏菌病患者尿液差異蛋白質組學分析

楊文濤，張建中，吳翠萍，王 磊，趙 利，倪秀瑩，藍 峰，姜 海，肖 迪

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌侵入機體所引發的傳染—變態反應性傳染病，是在全世界范圍內廣泛傳播的一種人獸共患病，世界衛生組織將布病列為7種最容易被忽視的疾病之一[1]。經文獻報道，布病可通過分娩、哺乳、性交、輸血及骨髓移植等途徑在人與人之間傳播[2]。人患布病后，可發生多器官受損，在急性期因誤診或治療不當可轉為慢性布病，嚴重影響生存質量，在我國乃至全球范圍內疾病負擔巨大。人畜間布病疫情在全世界170多個國家和地區均有報道，每年新發病例約有50萬例，布病流行國家的患病率超過每10/10萬人[3]。近年多有未直接接觸家畜的學生、兒童及離退休人員發病，表明布病已經由主要的職業接觸感染向非職業的食源性感染轉變，通過食用生鮮羊奶導致的食源性暴發公共衛生事件時有發生[4]。

目前，布病診斷依賴血清免疫學檢查結合病原學細菌分離實驗。常用的血清學檢查方法有虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗等。隨著國家對布病的重視，快速檢測技術已取得長足進步，間接酶聯免疫吸附試驗、膠體金免疫層析法等檢測方法逐步開始使用，但現有技術仍存在一定缺陷，對臨床診斷存在較大的漏診和誤診率[5]。實時熒光PCR是目前病原體檢測應用廣泛和穩定的分子診斷技術，在新突發性傳染病相關病原體感染的實驗室確證中具有不可替代的地位和作用[6]。但在病原體分子檢測領域存在突出問題：核心探針技術無自主知識產品，需要發展具有自主知識產權且性能更好的核心探針技術；布魯氏菌熒光PCR檢測產品尚無標準化試劑，且無標準化操作規程。針對國家高致病性傳染病應急處置的重大需求，創建新突發傳染病診斷方法、診斷試劑應急研發和產業化技術平臺，形成快速響應體系迫在眉睫[7]。

繼二維凝膠電泳-質譜可視化差異蛋白發現與確認技術之后，基于高效液相色譜-質譜串聯系統(UPLC-MS/MS)的定量差異蛋白質組學技術已發展成熟，可實現快速、高通量地獲得樣本中差異表達的蛋白，在發現診斷標志物、確定疫苗相關抗原、發現藥物作用靶點、闡述致病機理方面具有廣泛的應用[8-9]。尿液是一種易獲得、患者接受度高的檢測分析物，已成為多種疾病或生理特征監測與檢測的標本[10]。迄今國內外尚無采用定量蛋白質組學技術在人尿液標本中發現及確定布病診斷標示分子的報道。本研究將采用高效液相色譜-質譜串聯系統進行布病相關尿液定量蛋白質組學分析，通過專業軟件檢索確認差異表達的蛋白，并通過生物信息學分析軟件進行蛋白信號通路分析和生物標志物篩選分析，從而獲得蛋白表達“全景圖”，發現潛在的診斷布病的標志蛋白，挖掘關鍵蛋白的相關生物信息，在蛋白水平上為今后布病診斷、監測及治療提供分子線索。

1 材料與方法

1.1 樣本信息 布病患者樣本來自于已通過血清學檢查確診，試管凝集試驗(SAT)滴度為1∶100及以上或血培養中分離到布魯氏菌加之臨床表現或有流行病學史明確確診的人群。非布病患者樣本來源為非布魯氏菌感染、無臨床表現、無流行病學史的人群。兩組各10例樣本，按統一要求采集晨起中段尿液50 mL，采集后凍存-80 ℃。所有尿液樣本采集均經過倫理委員會審核。

1.2 樣本前處理

1.2.1 尿液蛋白提取和定量 將樣本從-80 ℃冰箱中取出后，12 000 g 4 ℃離心10 min，取上清3.5 mL，加入8倍體積-20 ℃預冷含20%三氯乙酸(TCA)的丙酮溶液，混勻后將樣本置于-20 ℃過夜；12 000 g 4 ℃離心30 min后，棄上清，向沉淀中加入8倍體積-20 ℃預冷丙酮，振蕩混勻后置于-20 ℃ 4 h；12 000 g 4 ℃離心30 min后, 棄上清，室溫下靜止2～3 min使沉淀干燥。用8 mol/L尿素溶解蛋白沉淀，震蕩混勻后BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific, USA)測定蛋白濃度。

1.2.2 溶液內酶解 向提取的蛋白溶液中，加入200 mmol/L 三(2-羧乙基)膦(TCEP)，混勻后室溫放置1 h進行還原，再加入375 mmol/L碘乙酰胺(IAA)，混勻后避光放置30 min進行烷基化。向處理好的樣本中加入6倍體積-20 ℃預冷丙酮，混勻后-20 ℃過夜放置，8 000 g 10 min 后棄上清，室溫下靜置2～3 min 使沉淀干燥，沉淀中加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3混勻，按胰酶和蛋白1∶50質量比加入胰酶，混勻后37 ℃水浴過夜。

1.2.3 肽段除鹽和定量 向樣本中加入10%三氟乙酸(TFA)后，用C18 除鹽柱(Thermo Fisher Scientific, USA)對肽段進行純化，氮氣吹干樣本。對所有樣本用肽段定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific, USA)進行定量。

1.3 高效液相色譜-質譜串聯分析 肽段定量后，每個樣本取1 μg肽段使用EASY-nLCTM1000色譜儀(Thermo Fisher Scientific, USA)進行分離。流動相A液為0.1%甲酸水溶液，流動相B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈80%)。色譜分析柱: PepMap 100, nanoViper C18,100 ?, 3 μm, 75 μm×25 cm，預柱: PepMap 100, nanoViper C18,100 ?, 5 μm, 100 μm×2 cm。流速為300 nL/min。液相梯度設置：0～45 min, B液4%～15%；45～73 min，B液15%～25%;73～100 min, B液25%～40%; 100～105 min, B液40%～95%;105～120 min, B液95%。使用Q-ExactiveTMPlus質譜儀(Thermo Fisher Scientific, USA)Full MS/ddMS2(TopN)串聯模式采集數據，具體參數為:全掃描一級譜圖范圍300～1 800 m/z，分辨率70 000，最大積分時間100 ms，離子目標值3×106個。而后選擇10個最強母離子進行二級數據采集，高能碰撞解離，分辨率17 500，最大積分時間60 ms，離子目標值2×105個，設置串聯質譜掃描的動態排除時間為30 s。應用 Xcalibur 軟件(version 4.1, Thermo Fisher Scientific, USA)記錄譜圖。

1.4 數據分析

1.4.1 數據質量控制 為避免人為造成蛋白表達呈現差異，本研究采取以下方法確保數據的可靠性：為保證樣本處理一致性，同組尿液樣本同批次進行樣本前處理；為保證定量準確性，對所有酶切后的尿液蛋白肽段樣本進行再定量，每個樣本均取1 μg肽段進行高效液相色譜-質譜串聯分析；為保證色譜質譜檢測的穩定性，檢測樣本前高效液相色譜-質譜串聯系統進行校正,并在實驗過程中用保留時間校正液對樣本出峰時間和雜質峰進行監測。

1.4.2 蛋白質組數據分析 將10例布病患者與10例非布病患者的尿液樣本質譜數據對比，采用Proteome Discoverer(version 2.4, Thermo Fisher Scientific, USA)軟件檢索Proteomes-Homo sapiens(Human)數據庫(20 600條蛋白序列，下載日期2020年8月26日)。選擇兩個酶解漏切位點；半胱氨酸脲甲基化(carbamidomethyl)為固定修飾，蛋氨酸氧化(oxidation)為可變修飾；肽質量偏差為10 ppm，離子片段偏差為0.02 Da，用反轉數據庫去除假陽性。

1.4.3 生物信息學分析 將歸一化處理后蛋白定量數據中蛋白水平FDR閾值設置為0.01，剔除任意缺失的數據，對歸一化后的數據進行log2轉換，篩選組內變異系數小于0.3的數據進行單因素方差分析，并以非布病患者為對照得到蛋白表達的差異倍數(Fold Change)。將| Fold Change(log2)|>1.5，且BH法校正P<0.05定義為差異表達蛋白，同時對僅在一組中檢測到并在組內無任意缺失的蛋白定義為特異表達蛋白或缺失表達蛋白。使用“悟空”平臺(https://www.omicsolution.org/wkomics/main/)進行假設檢驗和GO富集分析。應用商業化生物信息分析軟件IPA(Ingenuity pathway analysis)對獲得的差異表達蛋白進行典型通路分析(Canonical pathways)和生物標志物篩查分析(Biomarker filter)。

2 結 果

2.1 高分辨液質聯用數據采集 使用UPLC-MS/MS采集尿液樣本的質譜數據，總離子流圖(Total Ion Chromatography，TIC)見圖1。本研究中質譜數據采集靈敏度高，TIC圖顯示所有樣本峰強度均大于1E10，同組的TIC圖總離子流強度變化趨勢基本一致，同組樣本的出峰時間偏差較小。

圖1 布病患者(A)和非布病患者(B)尿液樣本的總離子流圖

2.2 蛋白鑒定與數據質量評估 應用Proteome Discoverer軟件進行原始數據檢索，采用label-free定量分析方法將布病患者與非布病患者尿液樣本原始數據進行比對，得到定性和定量蛋白的數據。蛋白數據散點圖顯示了在每個采集時間點，譜圖與肽段的匹配(Peptide spectrum matching, PSM)的強度分布的集中范圍在105～1010(圖2A)，共采集到164 616條PSMs。樣本豐度圖顯示組內樣本蛋白相應肽段的豐度有較好的一致性，保證了定量分析時組間的可比性和定量的準確度(圖2 B)。UPLC-MS/MS分析定性鑒定了1 817個蛋白(unique peptide≥1)，其中定量鑒定到1 732個蛋白，蛋白定量數據經質量控制后將其中873個蛋白用于后續蛋白質組學分析。經差異倍數及顯著性水平篩選后，最終得到185個與布病相關的尿液差異表達蛋白，其中13個蛋白上調、172個蛋白下調，使用火山圖來確定兩組之間差異表達蛋白變化的意義。

圖2 散點圖(A)和樣本豐度圖(B)

和程度(圖3)。

圖3 差異表達蛋白火山圖

2.3 GO富集分析 使用GO二級術語的基因本體論分析，根據蛋白質在3個主要類別(細胞成分、分子功能和生物過程)中的參與情況對蛋白質進行分類。185個差異表達蛋白主要為細胞外外泌體、質膜和細胞外空間的成分；分子功能分類表明，大多數差異表達蛋白的細胞功能與鈣離子結合、肝素結合及蛋白質均與二聚活性有關；差異表達蛋白主要參與的生物過程包括細胞黏附、血管生成及細胞外基質組織等(圖4)。布病患者中缺失表達的胰島素樣生長因子2(IGF2)功能分類分析表明，該蛋白與骨骼系統發育、骨化和血小板脫顆粒等生物進程有關。

圖4 差異表達蛋白GO富集分析(前15條)

2.4 生物信息學數據挖掘 商業化軟件IPA是分析和挖掘多組學數據的生物信息分析平臺。IPA整合了已有公共數據庫、已知的生物學知識，經幾百名科學家人工閱讀生物醫學文獻、總結科研成果，構建了包含700多萬條生物信息的IPA支持數據庫，并不斷更新。IPA廣泛應用在多組學研究、靶標的發現及驗證、機制研究、生物網絡分析、生物標記物研究等研究領域，具有分析全面、數據可靠的特點。本研究應用IPA軟件對差異表達蛋白進行典型通路分析和生物標志物篩查分析，以確保數據結果的嚴謹性和準確性。本研究在尿液樣本中共發現185個與布病相關的差異表達蛋白，其中有1個蛋白在IPA數據庫中未匹配成功，因此對其余的184個差異表達蛋白進行了生物信息學分析。這些差異表達蛋白參與疾病和功能排名前五的是：細胞妥協、炎癥反應、細胞運動、癌癥、組織損傷和異常(圖5A)。這些差異表達蛋白參與了肝纖維化/肝星狀細胞活化、糖酵解、GP6 信號通路、LXR/RXR 激活和動脈硬化信號等45個經典通路(圖5B)。其中預測對糖酵解、GP6信號通路、LXR/RXR激活、葡萄糖生成及IL-15生產等共12個通路有抑制作用，預測對LPS/IL-1介導的RXR功能抑制通路有激活作用。本研究中發現IGF2蛋白在布病患者中表達缺失，其參與的調控網絡主要調節胚胎發育、器官形態和生物發育3種疾病和功能，重疊上下游調節因子后顯示有16個下游調節因子和6個上游調節因子(圖6)。對184個差異表達蛋白進行生物標志物篩選分析，發現有30個蛋白已作為多種疾病的效應、診斷、預測指標，其余的154個差異表達蛋白目前尚未作為其他疾病的生物標志物；此外有17個差異表達蛋白是本研究在人的尿液中首次發現并呈現布病表達差異的蛋白(表1)。

表1 人尿液中首次檢測到的17個差異表達蛋白

A：疾病和功能分布；B：信號通路分布

圖6 IGF2的調控網絡以及上下游調節因子(橙色代表上游調節因子，藍色代表下游調節因子)

3 討 論

基于高效液相色譜-質譜聯用的蛋白質組學已經成為研究生物標志物的熱門工具，疾病生物標志物的發現有助于疾病的診斷、預后效果的評估以及藥物靶點的發現，對臨床應用和疾病監測有著重要的意義。本研究采用UPLC-MS/MS對布病患者尿液進行定量蛋白質組學的檢測，采集的質譜數據靈敏度高、樣本定量一致性較好，為發現布病感染相關的生物標志分子提供了準確和可比的蛋白數據。本研究是生物標志分子的發現階段，獲得了大量的差異表達蛋白數據，通過數據深度挖掘在蛋白表達差異倍數、生物標志物應用和參與的經典信號通路分析方面發現更具研究意義的蛋白，后續將進一步擴大樣本量對所發現的差異蛋白進行驗證，獲得切實可用的生物標志分子，為開發基于尿液的布魯氏菌感染診斷試劑提供靶標抗原。

本研究共定性鑒定到1 817個蛋白，定量鑒定到1 732個蛋白。相較于非布病患者，布病患者尿液中有13個蛋白表達上調，172個蛋白表達下調。研究表明，機體感染病原體后，病原體與宿主免疫系統之間的持續相互作用會啟動復雜的免疫反應，以通過多種抗寄生物效應子功能阻止病原體感染和生長，包括抑制侵襲和細胞粘附，抗體依賴性細胞毒性和細胞抑制作用[11]。與布病感染相關差異蛋白的GO富集分析中, 其中一些功能條目支持了目前研究認為的可能與布病感染相關的分子生物學過程, 包括細胞黏附、炎癥反應和免疫反應等。此外，基于IPA數據庫，本研究發現17個蛋白在已有的人尿液相關研究中未見報道，這些差異表達蛋白可以對現有的公共數據庫進行補充。

布病患者尿液差異表達蛋白中IGF2、CD300分子樣家族成員f(CD300LF)、血清類粘蛋白1和2(ORM1,ORM2)、富含亮氨酸α-2-糖蛋白1(LRG1)、SH3結構域谷氨酸富集樣蛋白3(SH3BGRL3)、半胱氨酸豐富跨膜BMP調節劑1(CRIM1)和谷氨酸氨連接酶(GLUL)是更具潛力的診斷布病的候選標示蛋白。

IGF2有調節細胞生長、分化和新陳代謝的作用[12]。細菌感染后，細菌細胞壁脂多糖刺激單核巨噬細胞釋放TNF-α、白細胞介素等，均可促進生長激素分泌，間接促成IGF2及其受體合成及分泌[13]。本研究發現IGF2在健康人尿液中正常表達[14]，并已經用于威爾姆斯腫瘤、大腸癌、卵巢癌的診斷標志物，但在布病患者尿液樣本中缺失表達，提示IGF2在尿液中缺失表達可能是布魯氏菌感染后的特異性表現，可作為潛在的布病診斷生物標志物。人患布病的主要臨床表現是發熱、疲勞、關節痛和肌肉疼痛[15]，常見并發癥有骨關節炎[16-17]和血液系統并發癥[18]等。IGF2在體內參與了骨骼系統的發展和血小板脫粒等生物進程，提示尿液中IGF2的缺失表達可能對布病臨床并發癥有一定的預測作用。CD300家族的成員在白細胞膜上表達，該家族由7個基因組成，命名為CD300a到CD300g，可通過成對的觸發和抑制功能調節免疫反應[19]。樹突狀細胞(DC)是一類異質性白細胞，被認為是關鍵的抗原提呈細胞和免疫應答的重要啟動者[20]。CD300分子現已被證明其在體外和體內都能調節DC的功能[21]。本研究中CD300LF表達上調8.57倍，但在已有的人尿液相關研究中CD300LF蛋白未見報道，提示CD300LF上調可能是診斷布病感染的重要尿液標志蛋白。

潛在生物標記物表達水平的改變經常是非特異性的，并且可能在多種傳染性疾病中都會發生改變，這可能是炎癥介導的急性期反應信號轉導的作用[22]。ORM1和ORM2是與急性炎癥相關的蛋白，ORM蛋白主要的肝細胞中表達[23]。目前經過驗證ORM1的上調與乳腺癌有關[24]，腦脊液中ORM1的上調與慢性疲勞綜合癥有關[25]，血清中ORM1的上調與COVID-19相關[26]。本研究中ORM1和ORM2表達上調，上調倍數分別為6.14和4.22，并參與了LXR/RXR激活、動脈粥樣硬化信號、FXR/RXR激活和急性時相反應信號等信號通路。有研究表明RXR與FXR的異二聚體和RXR與LXR的異二聚體均可參與免疫反應[27-28]，進一步的提示ORM1和ORM2可能是布病診斷及感染后調節體內的免疫反應的重要蛋白。LRG1是參與蛋白相互作用、細胞粘附、信號轉導和細菌感染的急性炎癥的蛋白[29]。LRG1在人血清中含量豐富，主要由肝細胞產生，并與腫瘤發生和血管生成有關[30]。已有研究顯示LRG1的表達與亨廷頓病、帕金森病癡呆、肝癌、進行性核上性癱瘓疾病有關，但目前并未作為任何疾病的標志物。本研究中LRG1表達上調5.46倍，提示LRG1有潛力作為布病診斷候選標示蛋白。

有研究在潰瘍性結腸炎患者尿液中檢測到SH3BGRL3上調，SH3BGRL3在尿路上皮癌中的高表達與復發風險增加和生存率降低有關[31]。本研究中發現SH3BGRL3表達上調8.66倍。CRIM1是骨形態發生蛋白(BMPs)的拮抗因子，可抑制BMPs前蛋白轉變為成熟的BMPs，并且可以抑制成熟的BMPs呈遞到細胞表面的過程[32]。本研究中CRIM1表達下調10倍(差異倍數為0.10)。谷氨酰胺連接酶在氨解毒、酸堿平衡和細胞信號轉導中起重要作用[33]，并參與了血管生成過程中的病理性細胞遷移[34]。本研究中GLUL表達下調12.5倍(差異倍數為0.08)。因此，人尿液中蛋白SH3BGRL3表達上調、CRIM1表達下調和GLUL表達下調，可能對布病感染以及臨床并發癥的預測有指示作用。

布魯氏菌最重要的特征是能夠在吞噬細胞和非吞噬細胞內生存和繁殖。布魯氏菌主要毒力因子包括脂多糖(LPS)、T4SS分泌系統和BvrR/BvrS系統，它們可以與宿主細胞表面相互作用，形成早、晚BCV(含空泡的布魯氏菌)，并在細菌繁殖時與內質網(ER)相互作用[35]。目前對布魯氏菌致病機制研究表明布魯氏菌含有不同的毒力因子，可降低抗原提呈細胞的吞噬能力與抗原提呈能力，延緩細胞成熟，抑制細胞凋亡，減少相關細胞因子的釋放[36]。本研究中CD58等5個差異表達蛋白參與抑制樹突狀細胞成熟信號通路，表明這些差異表達蛋白可能延緩了細胞成熟，降低了機體對布病感染的免疫反應的調節。NF-κB轉錄因子是免疫反應、應激反應、細胞凋亡和分化的重要調節因子，細菌和病毒感染、炎性細胞因子和抗原受體的結合都能誘導NF-κB的激活[37]。有文獻報道稱布魯氏菌強弱毒株侵染小鼠巨噬細胞后可以不同程度地激活NF-κB通路，而布魯氏菌LPS對NF-κB信號通路的激活的影響不大[38]。但本研究中顯示布病感染后EGF等5個差異表達蛋白參與抑制NF-κB信號通路，提示布病感染后導致機體內蛋白表達差異，從而影響對不同信號通路的調節，因此人感染布病后對NF-κB信號通路的影響有待進一步研究。

目前傳染病的常規診斷主要依賴于對致病病原生物的檢測以及臨床癥狀的檢查，但也可以通過宿主標志物的分析實現對病原體感染的敏感的和早期的診斷[39]。另外，臨床中應用多個蛋白標志物往往比單個標志物在疾病機理，診斷和治療等方面可以提供更全面的信息[40]。本研究基于非標記定量蛋白質組學發現了多個潛在的布病相關標志蛋白，為布病臨床診斷、監測及治療提供了技術支撐。

利益沖突：無