柱前在線衍生-高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中?；撬?/h1>
2021-08-07 07:14:18張冬生翟洪穩河北省食品安全重點實驗室河北省食品檢驗研究院
食品安全導刊 2021年18期
□ 張冬生 李 強 翟洪穩 王 娟 河北省食品安全重點實驗室 河北省食品檢驗研究院
?；撬崾且环N含硫氨基酸，主要以游離狀態存在于動物乳汁、腦與心臟中，在哺乳動物的心臟中含量最高。?；撬岢四艽龠M大腦的正常發育外，還能增強機體的免疫力[1]。
常用的?；撬岷繙y定方法有酸堿滴定法、熒光法、氨基酸分析儀法、薄層掃描法和高效液相色譜法等[2-8]。?；撬釋儆跇O性大且無紫外吸收的化合物，需進行衍生化。食品安全國家標準食品中牛磺酸的測定方法為鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生高效液相色譜法[9]。樣品經預處理，在鈉離子氨基酸分析專用柱中被分離，再與OPA進行衍生反應，由熒光檢測器進行檢測，外標法定量。該方法具有靈敏度高、定量準確等優點，但是分離需使用專用的鈉離子氨基酸交換柱和柱后衍生反應器、衍生劑驅動泵等專用輔助儀器。本方法與國家標準測定方法不同，采用柱前在線加入OPA衍生化試劑，在堿性條件下與牛磺酸產生強熒光的物質，通過熒光檢測器測定衍生物的含量，以此來確定?；撬岬暮?，其操作簡單方便、檢測快速、靈敏，且不需輔助儀器，只需通過普通的液相色譜C18柱就可進行牛磺酸的測定。
1 材料與方法
1.1 儀器
Agilent 1200高效液相色譜儀（配有熒光檢測器），安捷倫公司；KQ-250DV超聲儀，昆山市超聲有限公司；3K15離心機，SIGMA公司。
1.2 試劑與配制溶液
1.2.1 試劑
牛磺酸標準品，純度≥98%,購于Chem Service；乙腈、甲醇、三水合乙酸鈉、氫氧化鉀，均為色譜純，購自上海阿拉丁公司；三乙胺、四氫呋喃、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸、2-巰基乙醇（C2H6OS）均為分析純，購自天津科密歐化學試劑公司；實驗用水為GB/T 6682- 2008規定的一級水；聚氧乙烯月桂酸醚（Brij-35），高級純,購自麥克林公司。
1.2.2 溶液配制
硼酸鉀溶液（0.5 mol/L）：稱取30.9 g硼酸，26.3 g氫氧化鉀，用水溶解并定容至1 000 mL。
鄰苯二甲醛衍生溶液：稱取0.60 g 鄰苯二甲醛，用10 mL甲醇溶解后，加入0.5 mL2-巰基乙醇和0.35 g Brij-35，用0.5 mol/L硼酸鉀溶液定容至1 000 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾[10]?，F用現配。
1.0 mg/mL的?；撬針藴蕛淙芤旱呐渲疲簻蚀_稱取100.0 mg牛磺酸標準品于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。將牛磺酸標準儲備液用水稀釋制備一系列標準溶液，標準系列濃度為：0.5 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL。
1.3 色譜條件
色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為0.01 mol/L NaAc+0.018%三乙胺+0.3%四氫呋喃，B相 為0.01 mol/L的NaAc水溶液+40%乙腈+40%甲醇。流速： 1.0 mL/min；柱溫：室溫；熒光檢測器設置：0～19 min，運行時間：1 min，梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
1.4 樣品處理
稱取5 g奶粉試樣（精確至0.01 g），加入40 ℃左右的溫水溶解，充分搖勻，加入80 μL冰乙酸，搖勻后移入 100 mL容量瓶中；于超聲波振蕩器中超聲10 min，用水定容至100 mL； 樣液離心，取上清液經0.45 μm微孔膜過濾。
1.5 測定
采用自動進樣器進行OPA柱前衍生：吸取硼酸緩沖液5.0 μL，然后吸取1.0 μL OPA試劑混合，用水洗針，吸取被測樣品0.5 μL，用水洗針，混合6次后依據上述色譜條件進樣。
2 結果與分析
2.1 方法優化
2.1.1 衍生試劑的用量
牛磺酸需與衍生試劑反應后利用熒光檢測器進行分析，因此衍生試劑的選擇及用量非常重要，其直接影響檢測結果的準確性。本實驗對衍生試劑的用量進行研究，取3份0.5 μL牛磺酸（1 000 μg/L）標樣，分別加入 1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL衍生試劑后進行分析。實驗結果表明，在樣品與衍生試劑比例為1∶2時，測得色譜峰面積達到最大，且重復性良好，隨著衍生試劑用量的增加，測得的色譜峰面積沒有明顯變化，因此選擇樣品與衍生劑均為1∶2。
2.1.2 衍生化時間的選擇
衍生時間也對檢測結果產生影響，需考察不同衍生時間對?；撬嵫苌锓迕娣e的影響。OPA與硫醇試劑連用，在室溫堿性條件下與一級氨基酸的衍生化反應僅需30 s即可完成[10]。在其他條件不改變的情況下，本實驗對比了3種衍生時間，振蕩后直接進樣、混合振蕩后等待1 min和2 min進樣，對比3種反應時間，發現峰面積沒有區別，為節約檢測時間，選擇混合振蕩后直接進樣。
2.1.3 檢測波長的選擇
用5 μg/mL?；撬?標準溶液 按上述柱前在線衍生化反應，用熒光檢測器掃描發射波長和激發波長。發射波長的選擇：固定激發波長，在375～550 nm范圍內改變發射波長測定熒光強度。激發波長的選擇：把發射波長設置為優化好的數值，在260～400 nm范圍內改變激發波長測定熒光強度[11]。按照上述方法設置發射和激發波長，根據測定峰值確定?；撬岬臋z測波長為EX330 nm，EM530 nm。
2.1.4 標準曲線繪制
以標準溶液的濃度為橫坐標軸，吸收峰面積為縱坐標軸，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數，結果見表2。
根據表2的數據，由最小二乘法計算?；撬針藴是€的線性回歸方程y=47.261x+24.42，相關系數r=0.996。色譜峰面積與?；撬岷砍柿己镁€性關系，可用于奶粉中牛磺酸含量的定量檢測。
表2 ?；撬針藴是€測定結果
2.2 精密度實驗
精確吸取同一試樣溶液（25 μg/mL），按上述方法，進行6次平行測定，計算?；撬岱迕娣e的RSD=1.67%（n=6），結果如表3。
表3 精密度實驗
2.3 重復性實驗
取同一批樣品6份，準確稱量，按本方法處理，進行色譜條件測定，樣品中?；撬岷繛?0.93 mg/100 g（n=6），RSD為1.28%（n=6）。結果表明該方法重復性較好，具體數據見表4。
表4 重復性實驗
2.4 加標回收率實驗
在嬰幼兒配方奶粉樣品中加入已知含量的?；撬針藴嗜芤海凑毡痉椒ǖ脑囼灢襟E進行檢測，結果見表5。從表中可以看出，加標回收率在96.8%～103.6%，RSD=2.9%（N=6）。
表5 ?；撬峄厥章蕦嶒灲Y果
2.5 線性范圍確定
根據儀器信噪比，配制不同濃度的?；撬針藴嗜芤海蠙C測定，然后根據濃度和峰面積繪制工作曲線。經過多次試驗，結果表明當?；撬岬臐舛仍?.05～100 μg/mL的范圍內時，工作曲線仍然具有良好的線性關系，相關系數均能達到0.996。因此可以確定牛磺酸線性范圍為0.05～ 100 μg/mL。
3 結論
本方法使用自動進樣器進行程序設定，利用鄰苯二甲醛作為柱前衍生劑，完成樣品在線柱前衍生，奶粉樣品只需要經過水的溶解、冰乙酸沉淀蛋白、過濾處理后即可上機檢測，與離線柱前衍生方法相比，減少了煩瑣的手工操作和誤差，與柱 后衍生方法相比，無需配備專用的柱后衍生儀器，前處理方法簡單，操作方便，節約了分析成本，易于推廣。該方法還具有較寬的線性范圍、較高的回收率和良好的穩定性，能達到嬰幼兒配方奶粉中?；撬岬臋z測 要求。
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常用的?；撬岷繙y定方法有酸堿滴定法、熒光法、氨基酸分析儀法、薄層掃描法和高效液相色譜法等[2-8]。?；撬釋儆跇O性大且無紫外吸收的化合物，需進行衍生化。食品安全國家標準食品中牛磺酸的測定方法為鄰苯二甲醛（OPA）柱后衍生高效液相色譜法[9]。樣品經預處理，在鈉離子氨基酸分析專用柱中被分離，再與OPA進行衍生反應，由熒光檢測器進行檢測，外標法定量。該方法具有靈敏度高、定量準確等優點，但是分離需使用專用的鈉離子氨基酸交換柱和柱后衍生反應器、衍生劑驅動泵等專用輔助儀器。本方法與國家標準測定方法不同，采用柱前在線加入OPA衍生化試劑，在堿性條件下與牛磺酸產生強熒光的物質，通過熒光檢測器測定衍生物的含量，以此來確定?；撬岬暮?，其操作簡單方便、檢測快速、靈敏，且不需輔助儀器，只需通過普通的液相色譜C18柱就可進行牛磺酸的測定。
1 材料與方法
1.1 儀器
Agilent 1200高效液相色譜儀（配有熒光檢測器），安捷倫公司；KQ-250DV超聲儀，昆山市超聲有限公司；3K15離心機，SIGMA公司。
1.2 試劑與配制溶液
1.2.1 試劑
牛磺酸標準品，純度≥98%,購于Chem Service；乙腈、甲醇、三水合乙酸鈉、氫氧化鉀，均為色譜純，購自上海阿拉丁公司；三乙胺、四氫呋喃、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸、2-巰基乙醇（C2H6OS）均為分析純，購自天津科密歐化學試劑公司；實驗用水為GB/T 6682- 2008規定的一級水；聚氧乙烯月桂酸醚（Brij-35），高級純,購自麥克林公司。
1.2.2 溶液配制
硼酸鉀溶液（0.5 mol/L）：稱取30.9 g硼酸，26.3 g氫氧化鉀，用水溶解并定容至1 000 mL。
鄰苯二甲醛衍生溶液：稱取0.60 g 鄰苯二甲醛，用10 mL甲醇溶解后，加入0.5 mL2-巰基乙醇和0.35 g Brij-35，用0.5 mol/L硼酸鉀溶液定容至1 000 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾[10]?，F用現配。
1.0 mg/mL的?；撬針藴蕛淙芤旱呐渲疲簻蚀_稱取100.0 mg牛磺酸標準品于100 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。將牛磺酸標準儲備液用水稀釋制備一系列標準溶液，標準系列濃度為：0.5 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL。
1.3 色譜條件
色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為0.01 mol/L NaAc+0.018%三乙胺+0.3%四氫呋喃，B相 為0.01 mol/L的NaAc水溶液+40%乙腈+40%甲醇。流速： 1.0 mL/min；柱溫：室溫；熒光檢測器設置：0～19 min，運行時間：1 min，梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
1.4 樣品處理
稱取5 g奶粉試樣（精確至0.01 g），加入40 ℃左右的溫水溶解，充分搖勻，加入80 μL冰乙酸，搖勻后移入 100 mL容量瓶中；于超聲波振蕩器中超聲10 min，用水定容至100 mL； 樣液離心，取上清液經0.45 μm微孔膜過濾。
1.5 測定
采用自動進樣器進行OPA柱前衍生：吸取硼酸緩沖液5.0 μL，然后吸取1.0 μL OPA試劑混合，用水洗針，吸取被測樣品0.5 μL，用水洗針，混合6次后依據上述色譜條件進樣。
2 結果與分析
2.1 方法優化
2.1.1 衍生試劑的用量
牛磺酸需與衍生試劑反應后利用熒光檢測器進行分析，因此衍生試劑的選擇及用量非常重要，其直接影響檢測結果的準確性。本實驗對衍生試劑的用量進行研究，取3份0.5 μL牛磺酸（1 000 μg/L）標樣，分別加入 1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL衍生試劑后進行分析。實驗結果表明，在樣品與衍生試劑比例為1∶2時，測得色譜峰面積達到最大，且重復性良好，隨著衍生試劑用量的增加，測得的色譜峰面積沒有明顯變化，因此選擇樣品與衍生劑均為1∶2。
2.1.2 衍生化時間的選擇
衍生時間也對檢測結果產生影響，需考察不同衍生時間對?；撬嵫苌锓迕娣e的影響。OPA與硫醇試劑連用，在室溫堿性條件下與一級氨基酸的衍生化反應僅需30 s即可完成[10]。在其他條件不改變的情況下，本實驗對比了3種衍生時間，振蕩后直接進樣、混合振蕩后等待1 min和2 min進樣，對比3種反應時間，發現峰面積沒有區別，為節約檢測時間，選擇混合振蕩后直接進樣。
2.1.3 檢測波長的選擇
用5 μg/mL?；撬?標準溶液 按上述柱前在線衍生化反應，用熒光檢測器掃描發射波長和激發波長。發射波長的選擇：固定激發波長，在375～550 nm范圍內改變發射波長測定熒光強度。激發波長的選擇：把發射波長設置為優化好的數值，在260～400 nm范圍內改變激發波長測定熒光強度[11]。按照上述方法設置發射和激發波長，根據測定峰值確定?；撬岬臋z測波長為EX330 nm，EM530 nm。
2.1.4 標準曲線繪制
以標準溶液的濃度為橫坐標軸，吸收峰面積為縱坐標軸，繪制標準曲線，計算回歸方程及相關系數，結果見表2。
根據表2的數據，由最小二乘法計算?；撬針藴是€的線性回歸方程y=47.261x+24.42，相關系數r=0.996。色譜峰面積與?；撬岷砍柿己镁€性關系，可用于奶粉中牛磺酸含量的定量檢測。
表2 ?；撬針藴是€測定結果
2.2 精密度實驗
精確吸取同一試樣溶液（25 μg/mL），按上述方法，進行6次平行測定，計算?；撬岱迕娣e的RSD=1.67%（n=6），結果如表3。
表3 精密度實驗
2.3 重復性實驗
取同一批樣品6份，準確稱量，按本方法處理，進行色譜條件測定，樣品中?；撬岷繛?0.93 mg/100 g（n=6），RSD為1.28%（n=6）。結果表明該方法重復性較好，具體數據見表4。
表4 重復性實驗
2.4 加標回收率實驗
在嬰幼兒配方奶粉樣品中加入已知含量的?；撬針藴嗜芤海凑毡痉椒ǖ脑囼灢襟E進行檢測，結果見表5。從表中可以看出，加標回收率在96.8%～103.6%，RSD=2.9%（N=6）。
表5 ?；撬峄厥章蕦嶒灲Y果
2.5 線性范圍確定
根據儀器信噪比，配制不同濃度的?；撬針藴嗜芤海蠙C測定，然后根據濃度和峰面積繪制工作曲線。經過多次試驗，結果表明當?；撬岬臐舛仍?.05～100 μg/mL的范圍內時，工作曲線仍然具有良好的線性關系，相關系數均能達到0.996。因此可以確定牛磺酸線性范圍為0.05～ 100 μg/mL。
3 結論
本方法使用自動進樣器進行程序設定，利用鄰苯二甲醛作為柱前衍生劑，完成樣品在線柱前衍生，奶粉樣品只需要經過水的溶解、冰乙酸沉淀蛋白、過濾處理后即可上機檢測，與離線柱前衍生方法相比，減少了煩瑣的手工操作和誤差，與柱 后衍生方法相比，無需配備專用的柱后衍生儀器，前處理方法簡單，操作方便，節約了分析成本，易于推廣。該方法還具有較寬的線性范圍、較高的回收率和良好的穩定性，能達到嬰幼兒配方奶粉中?；撬岬臋z測 要求。
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