液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中甲硝唑和地美硝唑的含量

□ 張黎梅 許 秦 鄭世妍 汪云飛 昆明市食品藥品檢驗所

蜂蜜是一種高營養價值的食品，深受人們的喜愛，因此蜂蜜中有害物質的殘留給人體健康帶來的危害也引起了人們廣泛的關注。蜂蜜中殘留的甲硝唑和地美硝唑等硝基咪唑類藥物嚴重危害著人們的健康。硝基咪唑類藥物具有抗原蟲和抗厭氧菌活性，主要用于預防和治療畜禽組織滴蟲病和豬密螺旋體性痢疾、阿米巴原蟲以及厭氧菌感染等疾病[1]。長期攝入硝基咪唑類藥物具有致突變性和潛在的致癌性，如果在動物中使用會對動物源性食品安全構成威脅。被歐盟，美國、加拿大等多個國家列為違禁藥物[2]，食品安全國家標準 GB 31650-2019[3]規定，地美硝唑和甲硝唑允許作治療用，但不得在食品中檢出獸藥。

我國標準GB/T 23410-2009[4]提出了液相色譜-質譜/質譜法測定蜂蜜中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量的測定，但在研究中發現使用該方法測定，甲硝唑和地美硝唑的回收率不高，本文在國家標準基礎上進一步選擇優化前處理等步驟，建立了同時檢測蜂蜜中甲硝唑和地美硝唑的含量方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 實驗儀器

LCMS-8045型高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀（日本島津公司）、超純水儀（sartorius公司）、旋轉蒸發儀（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、CP224C型分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）

1.1.2 試劑

乙酸乙酯、甲醇、乙酸銨均為色譜純（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲硝唑（0.25 g，德國Dr公司）；地美硝唑（0.25 g，德國Dr公司）

1.2 實驗內容及方法

1.2.1 甲硝唑、地美硝唑標準工作溶液配制

準確稱取0.011 42 g甲硝唑標準品、0.010 18 g地美硝唑標準品分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容得 到114.2 μg/mL、101.8 μg/mL的標準儲備溶液。分別準確吸取標準溶 液0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、 0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇-水定容至刻度。

1.2.2 樣品提取

準確稱取混合均勻的樣品10.00 g（精確到0.01 g）試樣，放置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉水溶液，渦旋混勻。后加入15 mL 乙酸乙酯渦旋5 min，超聲提取 10 min。再以3 500 r/min離心 5 min，取上層乙酸乙酯到50 mL雞心瓶中，再加入10 mL乙酸乙酯，重復上述提取步驟，合并提取液，40 ℃水浴旋至近干，加入5 mL甲醇溶解殘渣，然后過經甲醇預淋洗的SPE柱凈化，加入10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃水浴旋至近干，甲醇-水溶解定容至1 mL，待測。

1.2.3 儀器條件

液相色譜條件：液相色譜-質譜儀(串聯四級桿)：配有電噴霧離子源；色譜柱：C18柱，100 mm×3.0 mm， 粒徑1.7 μm；流動相：A相為 10 mmol/L的乙酸銨溶液，B相為甲醇溶液；梯度洗脫，流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI源）；檢測方式：多反應監測（MRM）；掃描方式：采用正離子模式掃描。質譜條件如表1所示。

表1 甲硝唑和地美硝唑質譜參數

2 結果與分析

2.1 標準圖譜

通過不同的比例梯度程序來考察兩組分的出峰、峰形、色譜分離情況，最終選擇1.2.3的色譜條件，分離效果見圖1。

圖1 甲硝唑和地美硝唑多反應監測色譜圖

2.2 線性關系

對濃度范圍為1～100 ng/mL標準序列工作液按選定的色譜條件進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標做線性回歸方程。由表2可知，甲硝唑和地美硝唑在1～100 ng/mL范圍內線性良好，相關系數r2均在0.999以上。

表2 甲硝唑和地美硝唑的回歸方程和相關系數

2.3 回收率、精密度和檢測限

稱取蜂蜜樣品10.00 g（精確至 0.01 g），加入甲硝唑（114.2 μg/mL）、地美硝唑（101.8μg/mL）標準儲備液20 μL、30 μL、80 μL。按 照 上文所述提取方法處理樣品，上機檢測，根據測定濃度與加入量之間的差異來計算其回收率，回收率在78.57%～116.02%。甲硝唑和地美硝唑的相對標準偏差RSD值分別為：3.406%、4.081%，檢測限分別為 0.27 μg/kg和0.38 μg/kg。詳見表3

表3 甲硝唑和地美硝唑的回收率、精密度和檢測限

2.4 樣品的測定

實驗通對市場購買的4種蜂蜜（大姚野壩子蜂蜜，冠生園蜂蜜，老山蜂蜜，洋槐蜂蜜）進行實驗，均未檢出甲硝唑和地美硝唑。

3 結果分析

3.1 提取液的選擇

因硝基咪唑類藥物具有酸、堿兩性，在弱堿性條件下以分子狀態游離，所以，一般常用于硝基咪唑類藥物的提取劑主要有二氯甲烷、乙腈、甲醇和乙酸乙酯。由于二氯甲烷毒性較大，為盡可能的保證實驗安全，選擇使用乙酸乙酯為本實驗的提取劑，實驗結果得出乙酸乙酯提取各樣品分離效果較為理想且回收率也較高。

3.2 前處理方法的優化

蜂蜜種類繁多，粘度差異較大，對于無結晶的樣品，攪拌均勻取樣，對于有結晶的固態樣品，應在低于 60 ℃水浴中加熱，不斷攪拌，樣品均勻后再取樣。以保證樣品均勻性，減小平行測定結果的誤差。

4 結論

本文建立了高效液相色譜-串聯質譜測定甲硝唑和地美硝唑的方法。實驗結果表明：甲硝唑與地美硝唑在1～100 ng/mL的范圍內線性關系良好，相關系數均為r2=0.999。回收率為78.57%～116.02%，相對標準偏差為3.406%～4.081%，檢出限（S/N=3）為0.27 μg/kg、0.38 μg/kg，結果較為理想。本實驗前處理較為簡單，回收率，精密度，檢出限較好，能夠快速，準確地測定蜂蜜中的甲硝唑與地美硝唑含量。