乳粉中沙門氏菌的檢測能力驗證結果分析

□ 宋海珍 魏萬彩 馬 慶 祁疊鳴 石紅霞 蘭州中檢科測試技術有限公司

沙門氏菌為革蘭氏陰性桿菌，屬于腸桿菌科，無莢膜和芽孢。其在自然界有廣泛的宿主，主要在動物及人體腸道生長繁殖[1]。近年來，因食品污染沙門氏菌而發生的食源性疾病或食品安全事件屢見不鮮[2]，已引起社會的廣泛關注，因此，在食品微生物檢測中，沙門氏菌的檢驗必須加以高度重視。

能力驗證能否通過是評價實驗室檢驗水平的重要依據，因此蘭州中檢科測試技術有限公司微生物檢測部參加外部能力驗證或實驗室間比對以驗證實驗室能力，保證實驗結果的準確性和可靠性，以提高檢測機構競 爭力[3]。

1 材料與方法

1.1 樣品

實驗室共收到中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的檢測能力驗證計劃的2份乳粉樣品，樣品編號分別是20-J 793和20-K 562，每份樣品均為白色凍干塊狀，西林瓶真空包裝。

1.2 培養基與試劑

緩沖蛋白胨水BPW；四硫磺酸鈉煌綠增菌液；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液；亞硫酸鉍瓊脂；沙門氏菌屬顯色培養基；營養瓊脂；沙門氏菌干制生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術有限責任公司；沙門氏菌屬診斷血清，寧波天潤生物藥業有限公司；沙門氏菌陽性菌株鼠傷寒沙門氏菌（CICC 21484）中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.3 儀器

電熱恒溫培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；生物安全柜，Nuaire；胃氏均質儀；BagMixer，interscience；電子天平，江蘇常熟市雙杰測試儀器廠；一次性無菌培養皿；無菌稱樣袋；黃口試劑瓶；錐形瓶；試管；移液管等。

1.4 方法

參照能力驗證作業指導書和《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4-2016）[4]進行實驗。所有步驟均為無菌操作。

1.4.1 樣品前處理

從冰箱中取出樣品放進生物安全柜，待其溫度恢復室溫后將樣品的西林瓶打開。樣品需要用60 mL稀釋液再水化。具體操作步驟為：樣品開啟后，立即加入5 mL緩沖蛋白胨水（BPW）進行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再用余下的稀釋液清洗西林瓶內壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液是待測樣品原液，等同于60 mL的乳品樣品。

1.4.2 預增菌

吸取待測樣品原液25 mL于無菌均質袋內，再稱取225 mL緩沖蛋白胨水，用胃氏均質器拍打2 min。將編號2份增菌液、陽性對照和空白對照放置于電熱培養箱，36 ℃培養18 h。

1.4.3 增菌

輕輕晃勻預增菌培養物，各移取1 mL，分別轉種于10 mLTTB 和 10 mLSC，前者于42 ℃恒溫水浴鍋培養24 h，后者于36 ℃培養箱培養24 h。

1.4.4 分離

用10 μL一次性接種環取增菌液，分別劃線于BS瓊脂平板和沙門氏菌屬顯色培養基平板進行分離，于36 ℃分別培養48 h（BS瓊脂平板）和24 h （沙門氏菌屬顯色培養基平板）。

1.4.5 生化鑒定實驗

從2個樣品的選擇性培養基平板上分別挑取典型菌落3個，接種TSI，先在斜面劃線，再進行底層穿刺，同時直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養基和營養瓊脂平板，于36 ℃培養24 h。將營養瓊脂平板上純化后的菌落用生理鹽水制備成濁度適當的菌懸液，使用生化鑒定試劑盒進行鑒定。

1.4.6 血清學鑒定

1.4.6.1 檢查培養物有無自凝性

取一片潔凈的載玻片，先在上面滴加一滴生理鹽水，再刮取待測菌混勻，30～60 s后在黑色背景下晃動載玻片并觀察反應，如果出現菌體凝集成塊或肉眼可見的顆粒，即認為有自凝性，反之無自凝性。對未出現自凝性的細菌培養物按照下面方法進行血清學鑒定。

1.4.6.2 多價菌體抗原O鑒定

在玻片上劃出2個約1 cm×2 cm 的區域，挑取1環待測菌，各放1/2環于玻片上的每一區域上部，在其中一個區域下部加1滴多價菌體O抗血清，在另一區域下部加入1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環或針分別將2個區域內的菌苔研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，并對著黑暗背景進行觀察，任何程度的凝集現象皆為陽性反應。

1.4.6.3 多價鞭毛抗原H鑒定

操作同1.4.6.2。

2 結果與分析

2.1 選擇性分離結果

觀察各個平板上生長的菌落,菌落特征見表1。從表1的描述可推斷2份樣品均可能檢出沙門氏菌。

表1 選擇性培養基上的菌落特征

2.2 生化鑒定結果

將2份樣品在BS瓊脂平板和沙門氏菌屬顯色培養基平板的所有菌落形態在營養瓊脂平板上純化，然后使用生化鑒定試劑盒進行鑒定,生化項目包括三糖鐵、賴氨酸脫羧酶、氰化鉀、靛基質、尿素、甘露醇、山梨醇、ONPG，結果均與沙門氏菌屬生化特性一致，詳細結果見表2。

表2 不同菌落形態的生化反應結果

2.3 血清分型結果

按照GB 4789.4-2016對2個樣品進行血清學鑒定，發現A～F多價O血清、H多價2、H多價4均凝集，故進一步開展血清分型，結果見 表3。

表3 血清分型結果

3 結論

此次實驗中選擇性瓊脂培養基直接采用了BS瓊脂平板和沙門氏菌屬顯色培養基平板，后者相比木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂和HE瓊脂，對沙門氏菌屬有更高的特異性，可以排除大腸菌群及其他雜菌的干擾。

多價鞭毛抗原（H）鑒定時，直接從培養基上刮取待測菌混勻于診斷血清中，凝集效果不好。參照國家標準，發現可能是因為H抗原發育不良的緣故，經過多次試驗，將菌株接種在0.6%半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長時,在其邊緣部分刮取待測菌混勻于診斷血清中，幾分鐘后就出現了細菌凝集成塊或肉眼可見的顆粒，凝集效果有了明顯提高，后期再做血清學鑒定時可采用此方法。

能力驗證是檢驗實驗室人員是否具備檢測某個項目的技術能力，是提高實驗室整體檢測水平的重要途徑[5]。本實驗室此次能力驗證結果與考核方一致，結果為滿意。