特異位點DNA甲基化常用檢測技術及應用進展

姚燕麗 黃宇哲 韓芝斌 曹春玲 吳靜標

DNA 甲基化是表觀遺傳學領域研究的重點之一［1］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，基因組DNA 序列上CpG 島的二核苷酸5′端胞嘧啶轉變為5′甲基胞嘧啶。DNA 的異常甲基化通常發生在腫瘤的超早期，是腫瘤生長的“種子”因素［2］。CpG 存在兩種形式，一種為分散型的中高度重復序列；另一種為高度聚集，形成CpG 島［3］。CpG 島中的CpG 一般是非甲基化狀態，其異常甲基化與腫瘤息息相關。甲基化一般都是連續發生的，即某一CpG 位點發生甲基化，那么該位點上下游一定區域內的CpG 也發生甲基化。研究表明，基因組啟動子區甲基化，會改變重要遺傳基因表達，是導致癌癥發生的原因之一［3］。隨著癌癥進程改變，甲基化也會動態改變。此外，不同腫瘤的甲基化圖譜也存在明顯的差異。綜上，利用甲基化檢測對腫瘤進行早期篩查具有很大應用潛力［4］。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），屬于血液循環游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的一種，作為近年來腫瘤領域檢測的研究重點，在腫瘤無創前期早篩中具有重要應用價值。本文將綜述甲基化的各檢測技術，對DNA 甲基化的臨床應用情況進行總結，分析相關產品目前存在的技術難點及未來發展趨勢。

1 特異位點甲基化檢測方法

有效的甲基化基因檢測手段是應用的關鍵。近年來，市面上出現了不少DNA 甲基化的檢測技術，發展已達十幾種［5-6］，按照技術類型，分為甲基化特異性擴增技術［如甲基化特異性PCR、甲基化特異性半巢式/巢式PCR、甲基化敏感性限制性內切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern 法）、甲基化測序檢測分析技術（如亞硫酸氫鹽測序、簡化表觀亞硫酸氫鹽測序、甲基化敏感性單核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）］、甲基化基因芯片及圖譜檢測技術［如甲基化特異性寡核苷酸芯片、限制性酶切基因掃描技術、甲基化敏感性單鏈構象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）］、甲基化傳感器檢測分析技術（如基于OsO4 氧化的電化學傳感器、化學氧化裂解誘導的指數擴增反應、基于比例競爭型定量PCR 的橫向流動核酸生物傳感器）［7］，此外，磁珠和油包水微液滴結構的數字PCR 技術（BEAMing 技術）、納米芯片技術也被應用到DNA 甲基化的檢測中。特異位點甲基化檢測一般作為后期的技術驗證手段。見表1。

表1 特異位點甲基化檢測方法匯總Table 1 Summary of methods for detecting DNA methylation at specific sites

不同的特異性位點甲基化檢測技術各有優劣勢?？傮w而言，其檢測覆蓋范圍可分為大、中、小三個程度［5-6］：大范圍的檢測是全基因組甲基化測序技術，檢測位點廣泛但費時費錢；中等覆蓋度的檢測可用芯片捕獲測序技術，對熱點進行針對性檢測，成本較低；小范圍則用甲基化特異性PCR技術，可對多個熱點甲基化狀態快速、準確檢測，無需測序，費用相對低。目前應用最多的是后兩種檢測方法［10-11］。中低覆蓋程度檢測都需針對熱點區域，設計特異性探針或引物，檢測靶標區域的甲基化狀態。熱點區域的篩選，即生物標記物（biomarker）篩選，又稱為靶標區域或靶標位點的篩選。見表2。

表2 甲基化biomarker 篩選方法Table 2 Screening methods of methylated biomarker

以上方法雖有一定應用性，但限制缺點較大。因此，研發新篩選方法，對DNA 甲基化檢測和基于甲基化檢測的腫瘤早期篩查具有重要意義。

2 DNA 甲基化的臨床應用

DNA 甲基化的臨床應用領域包括非腫瘤與腫瘤疾病［6-7］。非腫瘤甲基化檢測主要用于炎癥性疾病、代謝性疾病、感染性疾病、心血管疾病等［12-15］。腫瘤甲基化檢測主要用于肺癌、結腸癌、膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤的早期診斷和預后分析治療等［16-19］。腫瘤中普遍存在DNA 異常甲基化，其特點是甲基化水平總體降低與局部升高。低甲基化可誘導原癌基因和轉座子活化、基因印跡缺失以及染色體不穩定性增加，最終誘發腫瘤［20］。某些抑癌基因發生高甲基化，導致基因沉默，抑制腫瘤能力下降。見表3。

表3 部分基因甲基化對應腫瘤應用Table 3 Application of partial genes methylation in tumors

3 國家藥品監督管理局產品獲證情況匯總

目前，基于DNA 甲基化位點的檢測產品陸續面世，給疾病診斷篩查帶來福音。通過查閱國家藥品監督管理局，國內已獲證產品見表4。國內甲基化試劑盒轉化商業產品集中在近幾年，且獲批的都為甲基化特異性PCR 技術，主要原因還是該技術操作簡便、特異性強、靈敏度高等特點。目前甲基化檢測試劑盒檢測樣本類型多為cfDNA，特別是ctDNA，其檢測方法具有早期、無創、快捷、靈敏度高等特點?；谘簶颖局衏tDNA 的檢測克服實體瘤組織樣本的局限性，具有以下優點：①克服腫瘤組織取樣的異質性；②可以識別腫瘤轉移性；③可以重復活檢，使腫瘤克隆演變得以追蹤；④血液中ctDNA 半衰期僅有2 小時，實現實時監測腫瘤的變化。然而，血液ctDNA 含量很低，其檢測技術的靈敏度要求較高。

表4 國內NMPA 獲證情況Table 4 Products registered in NMPA

4 小結與展望

特異位點DNA 甲基化檢測手段發展至今，技術應用依然存在成本高、檢測量低、引物或探針設計不一影響效果等問題，因此，優化提升DNA 甲

基化檢測技術亟待解決。新技術如納米芯片技術、免疫組化與數字PCR 技術聯合、微流控芯片與質譜聯用或可應用到商用試劑盒檢測中。穩定實現甲基化轉化需要專業的數據分析人員對大數據進行分析，選擇出優質的靶標及成熟的核酸提取純化技術、超靈敏的PCR 或測序檢測平臺。基于ctDNA 的甲基化檢測，解決了重復取樣活檢、組織采樣存在異質性等問題。目前已實現轉化的甲基化位點不多且特異性稍差，為了獲得更高質量的ctDNA，建立國際或者國家標準的ctDNA 提純分離方法或者納入細胞系，對檢出限、背景干擾進行研究驗證至關重要。另外，是要檢測整個DNA 甲基化水平還是位點特異性甲基化水平，或是全基因組水平分析還是位點特異性分析，是否需達到單核苷酸分別率等問題，是選擇不同甲基化檢測技術時需考慮的核心問題，也是未來篩選、應用、驗證DNA 甲基化的研究方向，助力DNA 甲基化產品研發的關鍵。