耐鹽植物根際促生菌篩選及促生效應研究

代金霞，田平雅，沈聰，劉爽

寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021

鹽堿脅迫是典型的非生物脅迫之一，嚴重影響植物對營養元素的吸收，使植物正常的生長發育受到抑制，是導致農作物產量降低的重要環境因素（劉奕媺等，2018）。土壤鹽漬化制約著農業生產以及資源環境的可持續發展。中國鹽堿化土壤占地面積大，類型多樣，開發和利用鹽堿地資源，已成為保持中國農業持續發展的當務之急，也是進一步挖掘農業現有發展潛力的一條重要出路（王佺珍等，2017）。近年來，以耐鹽植物改良為核心的鹽堿地改良利用技術逐漸被重視起來。但鹽生植物的培育難度較大且周期長，幼苗期也會因為鹽堿地特殊的土壤性質導致其生理指標發生變化，出現成活率低、保存率低等現象（Zhou et al.，2017；Ma et al.，2019）。目前的研究表明，在鹽堿化土壤中施加微生物肥料可以有效地阻止土壤中的鹽分對樹木幼苗的危害（Mahmood et al.，2016；丁紹武等，2019）。微生物肥料中起主要作用的植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）不僅為土壤提供了所需要的離子，使土壤中離子狀態的不平衡得到調節，改善植物根際環境，提高植物的耐鹽性，而且為植物提供豐富的營養元素，被植物所吸收利用，對利用植被恢復改良鹽堿地起到積極的作用（Vessey，2003；Sheikh et al.，2016）。此外微生物肥料能減少化肥和農藥的使用，安全高效、環境友好，因此研究利用微生物肥料改良利用鹽堿地具有重要的意義。

寧夏銀北鹽堿區屬中國5大鹽堿土區的西北半干旱鹽堿土區，水資源缺乏。土壤鹽堿化已成為影響寧夏農業生產和經濟發展的限制性因素之一（何欣燕等，2018）。開展PGPR作為微生物肥料的研制和菌種開發工作，這是一項開辟肥源而保護生態環境的有效措施，對促進寧夏鹽堿地的修復和改良具有重要的推動作用。本研究以實驗室前期從寧夏銀北鹽堿地6種耐鹽植物根際土壤中分離篩選出的PGPR為對象，通過菌株間拮抗反應測試和促生特性測定結果，篩選高效PGPR構建復合菌群，并通過盆栽試驗驗證菌群對苜蓿和柳枝稷幼苗的促生效果，為有效利用植物根際促生菌改良鹽堿土壤提供菌種資源并奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤和菌株來源

于2017年5—7月，采用五點取樣法在寧夏銀北西大灘鹽堿地（38°50′23.8″N，106°23′54.1″E）中采集苜蓿Medicago sativa、枸杞Lycium barbarum、柳枝稷 Panicum virgatum、芨芨草 Achnatherum splendens、苦豆子 Sophora alopecuroides和檉柳Tamarix chinensis等6種耐鹽植物根際土壤。制備土壤懸液，梯度稀釋后涂布于LB平板上，28 ℃恒溫培養24—72 h，待菌落長出后劃線純化直至形成單菌落，共分離純化菌株110株。盆栽試驗供試土壤為銀北地區鹽堿土壤與營養基質1∶1混勻，土壤pH為8.6，有機質含量12.06 g·kg?1，全氮、全磷和全鉀含量分別為 0.57、0.58 和 21.76 g·kg?1；所用植物種子為苜蓿（Medicago sativa）和柳枝稷（Panicum virgatum）種子。

1.2 菌株的促生活性測定

1.2.1 菌株的解磷能力測定

將菌株接種于含有Ca3(PO4)2的PKO平板上，28 ℃培養3—7 d后能夠形成透明溶磷圈的為陽性菌株。采用鉬銻抗比色法測定陽性菌株發酵液中的有效磷含量。以不接菌的無機磷液體培養基為空白對照，在720 nm波長下測定反應液OD值，每個菌株設置3個重復，根據標準曲線公式計算得到菌株發酵液中的有效磷含量，以反應液中有效磷的含量表示菌株的解磷能力（李海云等，2018）。

1.2.2 菌株產ACC脫氨酶活性測定

將菌株接種于以ACC為唯一氮源的ADF培養基上，連續轉接5次后仍能正常生長的菌株初步認為能夠產生ACC脫氨酶。提取菌株DNA，用引物對 acdSf3（5′-ATCGGCGGCATCCAGWSNAAYCA NAC-3′）和 acdSr4（5′-GGCACGCCGCCCARRTGN RTA-3′）擴增ACC脫氨酶結構基因acdS，將獲得目的條帶為760 bp左右的PCR產物進行測序，序列在Genbank中進行Blast比對，確定目的片段為acdS基因序列片段，將該菌株視為產ACC脫氨酶陽性菌株（馮維維等，2016）。參考Penrose et al.（2003）、韓坤等（2015）的方法對陽性菌株的ACC脫氨酶活性進行定量測定。以單位蛋白含量的細菌菌體在單位時間內產生α-酮丁酸的量計為ACC脫氨酶活性，以牛血清蛋白為標準蛋白，采用Bradford比色法測定總蛋白的含量。

1.2.3 菌株分泌IAA能力測定

采用Salkowski比色法對菌株分泌IAA能力進行定性篩選，顏色變紅者為分泌IAA陽性菌株。制作IAA標準曲線，采用分光光度法定量測定陽性菌株IAA分泌量。將陽性菌株接種于含有L-色氨酸（100 mg·L?1）的 LB液體培養基中，28 ℃振蕩培養48 h后離心，取上清液5 mL于試管中，加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30 min，測定其 OD530值，以 LB液體培養基與等體積Salkowski比色液的混合液調零，根據標準曲線計算單位體積發酵液中相應的IAA濃度（Glickmann et al.，1995）。

1.2.4 菌株分泌鐵載體能力測定

將活化的菌株點接到 CAS檢測平板上，28 ℃恒溫培養3 d，菌落周圍出現明顯的橙黃色暈圈的為產鐵載體陽性菌株。采用CAS比色法對菌株產鐵載體能力進行定量測定（趙翔等，2006）。以波長680 nm處菌株與CAS檢測液的吸光值A與對照參比值Ar的比值（A/Ar）作為定量指標，比值越小，反映鐵載體的產量越大。每個菌株設置3個重復。

1.3 菌株的相容性檢測和菌種鑒定

根據菌株促生活性測定結果，選擇具有較高的單一活性或多種活性的 22個菌株，采用平板拮抗法檢測供試菌株之間的拮抗反應。以其中一株菌作為指示菌均勻涂布至LB固體平板上，將干熱滅菌的濾紙片間隔一定距離放置在涂有指示菌的平板上，將其它測試菌株的發酵液點接至濾紙片上，28 ℃培養箱恒溫培養 48 h，觀察指示菌與測試菌之間有無抑菌圈。依次以不同菌株作為指示菌進行上述操作，記錄菌株間的拮抗結果。選擇互不拮抗的菌株，進行革蘭氏染色和生理生化特征測定，根據《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠等，2001）對菌株進行初步鑒定。提取菌株基因組DNA，采用細菌 16S rRNA 基因通用引物 27F(5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)/1492R（5′-TACGGYTACC TTGTTACGACTT-3′）進行擴增，擴增產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后委托上海生工生物工程有限公司測序。序列拼接后在 GenBank（http://www.ncbi.nlm.nib.gov/）中進行同源性比對，對菌株進行分子鑒定。

1.4 PGPR復合菌群的構建及促生特性測定

根據菌株拮抗反應測定結果，選擇互不拮抗的11個菌株，用新鮮 LB培養液調整菌液 OD600=1.0±0.05。以每 4株菌為一個組合，按相同體積比混勻后，再按照4%的總接種量接種混合菌液至LB培養液中，28 ℃，150 r·min?1下恒溫培養 48 h，即為復合菌群。按照1.2的方法測定各復合菌群解磷、分泌IAA、產ACC脫氨酶和產鐵載體能力；在阿須貝無氮液體培養基中發酵培養后測定菌群的鮮質量。

1.5 PGPR復合菌群的促生效果驗證

1.5.1 復合菌群的選擇和菌劑制備

根據菌群促生特性的測定結果，選擇具有較高促生活性的兩組復合菌群C3和C8進行促生效果驗證。按照4%的總接菌量接種菌群混合液至LB液體培養基中，恒溫震蕩培養一定時間后，發酵液在無菌條件下離心棄上清液，菌體洗滌2次后加無菌水，制成 OD600=1.50±0.05的復合液體菌劑，用于盆栽試驗。

1.5.2 種子處理

選取大小一致、成熟飽滿、未受昆蟲侵害的紫花苜蓿種子，在50—60 ℃無菌溫水中浸泡30 min，用75%的酒精進行表面消毒1 min，無菌水洗滌3次；柳枝稷種子于濃度為5.25%次氯酸鈉中浸泡15 min，凈水洗20 min。洗凈的種子分別于OD600=1.50的復合菌劑中浸種2 h后，放置于28 ℃培養箱誘導種子萌發，以無菌水浸種相同時間處理為對照（CK），共設置6組。分別稱取500 g混勻后的土壤置于10 cm×15 cm的花盆中，取發芽勢一致的種子進行穴播，每盆15顆種子，每處理6盆。菌劑浸種處理組于幼苗長出的第7、14、30天各澆一次OD600=1.50的復合菌劑30 mL，對照組只澆等量無菌水，溫室培養，定期適當補充水分。

1.5.3 植物幼苗的生物量測定

紫花苜蓿和柳枝稷分別種植90 d和60 d后，每組分別取3盆，將植株連根取出，用自來水將根系仔細地沖洗干凈，然后用吸水紙將水吸干，用游標卡尺測量每株幼苗的株高和根長；將每盆幼苗地上和地下部分剪下分別稱質量作為鮮質量，在105 ℃殺青30 min，65 ℃或85 ℃烘干至恒質量，測定鮮質量，計算各盆測定的平均值。通過對處理組和對照組幼苗各生物量的比較，驗證復合菌群的促生效果。

1.6 數據處理

采用Excel和SPSS 19.0軟件進行數據處理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的促生活性分析

通過定性篩選，從6種耐鹽植物根際土壤中共獲得 23株解磷菌，這些菌株在解磷培養基上能夠產生明顯的溶磷圈（圖 1）。定量測定結果顯示，陽性菌株的解磷能力差別較大（圖 2），解磷量在2.90—70.92 mg·L?1之間，其中菌株 GQ2、KDZ12和LZJ12的解磷能力相對較高，分別達到70.92、70.22 和 70.14 mg·L?1。

圖2 解磷菌株的有效磷增量Fig.2 Available phosphorus content of phosphate dissolving strains

在以ACC為唯一氮源的ADF平板上轉接5次能夠正常生長的菌株有18株，通過ACC脫氨酶結構基因acdS的PCR擴增，其中6株能夠獲得大小約為 760 bp左右 acdS基因片段，經測序后在Genbank中進行同源性比對，確定目的片段為acdS基因序列。定量測定結果表明，6株陽性菌株產ACC脫氨酶的能力存在顯著差異，菌株MX31和KDZ12的 ACC 脫氨酶活性最大，分別為 1.56 μmoL·mg?1·h?1和 1.50 μmoL·mg?1·h?1， 其 次 是GQ11，為 1.14 μmoL·mg?1·h?1（圖 3）。

圖3 菌株ACC脫氨酶的活性Fig.3 ACC deaminase activity of strains

經過定性篩選，有 46株菌的發酵上清液與Salkowski比色液產生紅色反應，表明這些菌株具有分泌IAA的能力。定量測定結果表明，陽性菌株IAA分泌量在 1.33—34.74 mg·L?1之間，不同菌株間差異較大。其中，菌株JJC12分泌IAA能力最強，達到 34.74 mg·L?1；其次是 MX17，為 30.37 mg·L?1。部分菌株分泌IAA的能力如圖4。

圖4 菌株IAA分泌量Fig.4 IAA production of strains

在CAS檢測平板上有24個菌株能夠產生橙黃色暈圈，表明這些菌株具備分泌鐵載體的能力。定量測定結果顯示，絕大部分菌株A/Ar的值小于0.4，其中菌株MX18、MX22、LZJ13和KDZ12的A/Ar值小于0.2，具備很強的產鐵載體能力（表1）。

表1 菌株產鐵載體能力Table 1 Ability of siderophores secretion of tested strains

2.2 菌株相容性和菌種鑒定

拮抗反應是菌體細胞不親和性的具體體現，平板拮抗實驗能夠有效檢測菌株間的相容性。通過對22個菌株進行相容性檢測，共獲得了11株可用于構建復合菌群的 PGPR。其中，革蘭氏陰性細菌 5株，革蘭氏陽性細菌6株。結合菌株生理生化特征和16S rDNA序列分析對菌株進行鑒定，結果表明有6株菌隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），其中MX26、JJC11、LZJ12為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，GQ4和 GQ13為萎縮芽胞桿菌 Bacillus atrophaeus，KDZ12為蠟樣芽孢桿菌 Bacillus cereus；MX31、GQ2、GQ11和 LZJ3這 4株均為假單胞菌Pseudomonas brassicacearum；MX32為鞘氨醇桿菌Sphingobacterium kitahiroshimense，菌株16S rDNA的序列同源性和理化性質見表2。

表2 菌株的16S rDNA序列相似性和部分生理生化特征Table 2 16S rDNA sequence similarity and partial physiological and biochemical characteristics of strains

2.3 PGPR復合菌群的促生活性分析

以每4個互不拮抗的菌株進行組合，共構建9組PGPR復合菌群，命名為C1—C9。對其促生特性進行測定，結果表明復合菌群具備多種促生活性。其中，ACC 脫氨酶活性在 0.12—3.67 μmol·mg?1·h?1之間，依次為C8>C3>C1>C2>C6>C4>C9>C5>C7；不同菌群分泌IAA和解磷能力差別較大，IAA濃度在 4.62—13.30 mg·L?1之間，依次為C3>C4>C1>C2>C9>C8>C6>C7>C5；解磷量在3.52—56.96 mg·L?1之間，解磷能力為 C3>C8>C2>C1>C5>C7>C9>C6>C4；產鐵載體能力表現為 C1—C4組合相對較強（表3）。

2.4 PGPR復合菌群對植物幼苗生長的影響

根據菌群的促生能力和菌株的多樣性，選擇C3和C8這兩組復合菌群進行盆栽實驗。盆栽種植紫花苜蓿90 d、柳枝稷60 d后觀察發現，兩組復合菌群處理對兩種植物幼苗均具有明顯的促生效果（圖5）。

圖5 復合菌對苜蓿（A）和柳枝稷（B）的促生效果Fig.5 Growth Promoting effect of compound bacteria on Medicago sativa (A) and Panicum virgatum (B)

對植物幼苗各生物量的測定結果表明，與對照組相比，添加C3和C8復合菌群后，幼苗增長明顯，且地上部分的增長顯著高于地下部分。復合菌群C3對苜蓿幼苗的促生效果要明顯強于C8，使苜蓿幼苗的株高、地上鮮質量/鮮質量、地下鮮質量/鮮質量分別增長了 54.93%、113.80%/119.60%和 66.09%/49.92%，而根長的增長在兩個菌群間沒有顯著差異（表4）；兩組復合菌群對柳枝稷幼苗同樣具有明顯的促生效果，菌群C3對柳枝稷幼苗株高的促進作用顯著強于C8菌群，增長率達到50.96%，而幼苗根長、地上鮮質量/鮮質量、地下鮮質量等指標在兩組菌群間都無顯著差異（表 5）。綜合比較兩組復合菌群對苜蓿和柳枝稷幼苗的影響，發現C3和C8對植物幼苗的促生效果均展現出地上生物量優于地下。且不同菌群對同一植物、同一菌群對不同植物的促生效果均存在一定差異。

表4 復合菌群對苜蓿幼苗生物量的影響Table 4 The effect of compound bacteria on the biomass of Medicago sativa seedlings

表5 復合菌群對柳枝稷幼苗生物量的影響Table 5 The effect of compound bacteria on the biomass of Panicum virgatum seedlings

3 討論

土壤環境復雜多變，在過分依賴化肥和農藥以期追求農作物增產的時代背景下，人們也逐漸意識到生態保護與農業可持續發展的重要性。為了改善農業可持續發展，新型微生物肥料的研制就被提上了日程，研究證明添加微生物肥料可以提高肥料的利用率，同時減少化肥和農藥的使用。其中，植物根際促生菌因具有安全高效、環境友好的特點而成為目前的研究熱點（Kim et al.，2018）。很多研究報道了PGPR對各種作物增產、增效的多重功能，一些PGPR被開發成生物菌劑或肥料，在農業生產上具有防病促生和活化土壤等作用，其研究和產業化前景十分廣闊。孫廣正（2015）利用從小麥、紅三葉、苜蓿中篩選出的優良PGPR制成的復合菌肥可以顯著促進油菜生長；何志剛等（2013）的研究表明，增施促生菌肥的馬鈴薯產量比常規施肥提高12.4%，證明在配施生物菌肥的條件下提高馬鈴薯產量是可行的。經過PGPR菌肥處理后的燕麥、小麥的株高和生物量等均高于對照（Mahone et al.，2017；Muhammad et al.，2019）。李玉奇等（2012）在溫室中通過施用微生物肥料，黃瓜的總生物量、莖粗、葉面積指數、葉片數、根活力、葉片的光合特性以及品質均得到了提高。本研究結果表明，耐鹽植物根際定植的許多細菌都具有一種或多種促生活性，其中假單胞菌和芽孢桿菌是土壤中常見的根際促生菌，也是銀北鹽堿地中的優勢類群，不僅可以有效抵御外界的有害因子，也是一類重要的生防菌；鞘氨醇桿菌有著極強的生命力和抗逆性，對植物的生長也有直接或間接的促進作用。本研究選取了假單胞菌、芽孢桿菌和鞘氨醇桿菌等部分根際促生菌株構建了PGPR復合菌群，根據復合菌群促生特性的測定和盆栽效果驗證，結果顯示構建的 C3和 C8兩組復合菌群對鹽堿環境下植物幼苗都有明顯的促進生長作用，尤其是 C3菌群，使苜蓿和柳枝稷地上鮮質量分別增長 113.33%和 125.00%，促生長作用顯著。這與已有的一些研究結果相一致（Bulgarelli et al.，2015；Majeed et al.，2015；Agbodjato et al.，2016），表明在植物根際土壤中接種根際促生菌復合菌劑可明顯促進其生物量的提高。

PGPR是一類植物生長促進劑，其制成的菌肥施用后能提高植物根部土壤微生物種群密度，根際促生菌在植物根部定植之后，隨著生命活動的增強，菌株分泌各種促生素的能力也增加。有研究顯示產植物激素IAA是PGPR植物促生的主要因素之一，在較低濃度下就可以促進細胞的伸長生長，并且調節逆境脅迫條件下根系的發育過程，從而使根系的生長發育適應鹽脅迫（Vurukonda et al.，2016；郭軍康等，2015）。本研究選用的PGPR菌株都能在沒有色氨酸的情況下合成植物生長激素IAA，促進植株形成了一個細長或高度分枝的根系系統，盡管各處理的幼苗根長增長不明顯，但地下部分生物量仍然顯著增高，這表明PGPR菌群加強了植物對養分的吸收利用，增加了幼苗活力，促進了根系的發育。產鐵載體PGPR能有效增加土壤中鐵的有效性來滿足自身需求，不僅能改善植物的鐵營養狀況，還可以與植物根際病原菌爭奪有限的鐵元素，從而抑制病原菌的生長繁殖，起到生物防治作用。產 ACC脫氨酶的菌株通過抑制乙烯的合成來有效緩解植物體內乙烯的積累，減少過量乙烯對植物生長造成的不利影響，增強植物對鹽堿、干旱等逆境的適應性來間接促進植物生長和產量的提高（Glick，2014；代金霞等，2017）。研究中的兩組PGPR復合菌群不僅兼具ACC脫氨酶活性及分泌鐵載體的能力，還同時具有固氮和解磷能力，增加根際土壤中可利用的氮源和磷源，這些促生特性能夠不同程度地刺激和調節植物生長，緩解鹽堿脅迫，進而達到增產效果。此外，兩組復合菌群對不同植物的同一性狀及同種植物的不同性狀的促進效果又有不同，這也說明菌群促生效果的高低受菌株的種類、活性和植被類型等多種綜合因素的影響。

4 結論

銀北鹽漬化土壤中蘊藏著豐富的植物根際促生菌資源，芽孢桿菌和假單胞菌為優勢菌群；PGPR復合菌群對鹽堿環境下植物幼苗的生長具有明顯的促進作用，具備開發為鹽堿地改良的植物促生復合菌劑的潛能。