華中地區水庫型水源地抗生素抗性細菌的賦存特征研究

張凱 ，郭紫微 ，王倩 ，韓雅 ，李貺家，張中帥

1.信陽師范學院地理科學學院，河南 信陽 464000；2.河南省水土污染協同防治重點實驗室/信陽師范學院，河南 信陽 464000；3.水利部發展研究中心，北京 100038

抗生素耐藥性導致的環境問題近年來受到越來越多的關注（朱永官等，2018）。環境中殘留的抗生素促進了環境中微生物抗藥性的發展，導致環境中抗性細菌的大量繁殖（Jiang et al.，2018）。環境中的抗性細菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB）會通過水平轉移的方式將抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）傳播到病原菌中，從而對人體健康產生威脅（Allen et al.，2010；Yang et al.，2018）。目前，針對各個環境介質中ARGs及ARB中的研究層出不窮。大量研究結果表明，空氣、水及土壤等介質中均有不同程度的ARGs及ARB污染，環境中ARGs及ARB污染已不容忽視（Jiang et al.，2018；Yang et al.，2018；García et al.，2020）。

湖庫型水源地與人體健康密切，其用水安全也是最引人重視的研究之一。Han et al.（2020）的研究結果表明，即便經過飲用水處理設施的深度處理，湖庫型水源地中的菌落結構仍能夠對飲用水中的菌群組成造成直接影響。這一結果進一步凸顯了研究湖庫型水源地環境中耐藥菌的重要性。近年來，大量研究分析了湖庫環境中ARGs及ARB污染現狀（Pang et al.，2015；Nnadozie et al.，2019；Chen et al.，2019；Dang et al.，2020）。結果表明，湖庫環境中也受到了一定程度的 ARB污染，且不同地區ARB的污染狀況不盡相同。

華中地區為中國七大地理分區之一，其包括河南、湖北、湖南三省。該地區總面積約56×104km2，占全國國土總面積的約5.9%。截至2017年底，華中地區常住人口約2.23億人，生產總值約11.61萬億元，人均生產總值約5.20萬元。隨著近年來華中地區經濟的快速發展，該地區社會經濟地位日益凸顯。然而，經濟及工業的高速發展造成了該地區環境質量的惡化（彭佳雯等，2011；繆羽晨等，2019）。水庫是華中地區最重要的飲用水來源，在促進該地區經濟發展和繁榮、保障居民身體健康方面的作用不可替代。然而，目前缺乏對該地區供水水庫ARB賦存狀況綜合性的調查。因此，亟需研究明確華中地區水庫型水源地 ARB的分布特征，為控制該地區水庫環境 ARB及抗生素污染提供理論依據及數據支撐。

基于以上背景，本研究選取了華中地區 11個大型水庫型水源地，分析了水樣和底泥中耐藥菌的分布規律。本研究的主要目標有：（1）明確華中地區水庫型水源地中耐藥細菌的污染特征；（2）分析華中地區水庫型水源地不同環境介質中耐藥細菌的分布差異。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器及試劑

本實驗所用儀器包括：BSD-400恒溫振蕩培養箱（上海博迅實業有限公司），T100PCR擴增儀（美國Biorad），SW-CJ-1G無菌超凈工作臺（上海滬凈醫療器械有限公司），YM75Z高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）。

本實驗所用主要試劑包括：細菌基因組DNA提取試劑盒（美國Axygen），瓊脂糖（北京鼎國生物有限公司），50×TAE（天津莫克曼生物科技有限公司），PCRmix（南京諾維贊生物科技有限公司），瓊脂粉、酵母粉以及蛋白胨均購于北京奧博星生物技術有限公司），磺胺甲惡唑、氨芐西林、四環素、諾氟沙星以及鏈霉素均購于大連美侖生物技術有限公司。

1.2 水樣和底泥的采集與保存

本研究從華中地區選取了 11個供水水庫（圖1），其中4個水庫選自河南（HN1，HN2，HN3，HN4），3個水庫選自湖北（HB1，HB2，HB3），4個水庫選自湖南（HU1，HU2，HU3，HU4）。樣品于2019年10—11月進行。采集樣品時，每個水庫庫區分別設定一個 10000 m2的正方形區域，在該區域的4個頂點和中心位置各取1 L子水樣和20 g左右的表層沉積物。從每個子樣各取400 mL水和5 g沉積物樣品，分別于2.5 L采樣瓶中和無菌自封袋中混合均勻，在4 ℃條件下運至實驗室。

圖1 華中地區水庫采樣點示意圖Fig.1 Sampling sites of water supply reservoirs in central China

1.3 水樣和沉積物可培養細菌的計數

采用 10倍梯度稀釋法對水樣細菌進行培養以及計數。將每個取樣點所取水樣用無菌PBS稀釋4個梯度，每個梯度設置3個平行。每個樣品分取50 μL于LB固體培養基上涂布，于37 ℃培養48 h，隨后取合適梯度對細菌進行計數。

以5 mL無菌離心管為容器，在無菌條件下準確稱取0.2 g沉積物樣品。隨后向離心管加入2 mL無菌PBS溶液，充分混勻后吸取200 μL至新的5 mL無菌離心管中進行10倍梯度稀釋。每個采樣點稀釋5個梯度，此后所有實驗參數均與水樣10倍梯度法相同。

1.4 抗生素耐藥菌篩選

本研究選取的各類抗生素的最終濃度及參考文獻如表1所示。

表1 抗生素濃度信息Table 1 Related information of antibiotic concentration in this study

水樣和沉積物樣品按照10倍梯度稀釋法（0.5 mL+4.5 mL）分別稀釋2個梯度和3個梯度，每個梯度分別設置3個平行，分別吸取50 μL樣品均勻涂布于抗性平板上。以未添加抗生素的平板為對照，平板倒置于37 ℃條件下培養48 h，隨后取合適梯度對細菌進行計數（劉珊珊等，2018）。

1.5 耐藥菌株鑒定

從抗性平板上隨機挑選菌落形態有明顯差異的細菌進行劃線培養（葉繁等，2019），將純化后的單菌落接種到LB液體培養基中，于37 ℃條件下培養48 h，將菌液用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA。采用Nanodrop 2000核酸蛋白定量儀測定提取DNA的質量以及純度。以細菌基因組DNA為模板，采用25 μL體系對細菌的16S rDNA進行擴增。體系組成為：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，上、下游引物各 1 μL，1 μL DNA 模板，9.5 μL 雙蒸水。正向引物序列27F為：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，反向引物1492R為：5′-ACGGTTACC TTGTTACGACTT-3′。PCR產物立即于低溫條件下送往北京六合華大基因科技有限公司進行測序。測序結果在NCBI數據庫中進行同源性比對，根據比對結果確定細菌種屬。

1.6 統計學方法

實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。利用獨立樣本t檢驗進行差異性分析，P<0.05為差異有統計學意義。熱圖、相關性熱圖分別用R 3.6.1的 ggplot2及 ggcorrplot包繪制；mantel分析用 R 3.6.1的vegan包進行。

2 結果與討論

2.1 華中地區水庫型水源地上覆水中抗生素抗性細菌的分布特征

華中地區水庫型水源地 ARB的分布特征如圖2所示。各省水庫上覆水和沉積物中ARB分布不存在顯著性差異（t檢驗，P>0.05），表明華中地區水庫型水源地上覆水中ARB分布不存在地域性差異。華中地區各省的養殖業均比較發達。2016年華中地區各省豬、牛和羊的總量占全國總量的比例均比較接近。抗生素在養殖業的使用是造成環境中細菌耐藥性的重要因素。因此，華中地區相近的養殖業規模導致了該地區水庫中ARB不存在地域性差異。

圖2 華中地區水庫型水源地抗生素抗性細菌的分布特征Fig.2 ARB distribution pattern in water supply reservoirs of central China

上覆水和沉積物中豐度最高的兩類 ARB均是磺胺類 ARB（上覆水中平均相對豐度為 8.9%，在所有耐藥菌中的占比為45%；沉積物中平均豐度為7.0%，占耐藥菌總量的 54%）和 β-內酰胺類 ARB（上覆水中平均豐度為8.1%，在所有耐藥基因中的占比為38%；沉積物中平均豐度為3.2%，占耐藥菌總量的 27%），這可能與其對應抗生素的使用及特性有關。磺胺類抗生素有較長的使用歷史且仍是目前使用量最大的抗生素之一，每年有將近2000 t磺胺類抗生素被釋放到生物圈（Qiu et al.，2006）。此外，其具有較好的水溶性且難以降解，因此可以在環境中持續積累并提供選擇性壓力（Zhang et al.，2020）。此外，以氨芐青霉素為代表的β-內酰胺類抗生素近年來在醫療和畜牧業中被廣泛使用，Zhang et al.（2015）的研究結果表明，中國β-內酰胺類抗生素使用量為 34100 t，占中國抗生素總使用量的21%。因此，磺胺類和β內酰胺類抗生素的大量使用可能是導致水庫上覆水中 ARB廣泛存在的重要因素。

喹諾酮類ARB在本研究選取的5種抗生素中豐度最低，這可能和喹諾酮類抗生素本身的性質有關。排放到環境中的喹諾酮類抗生素并不穩定，光照、水和生物作用均能促進其降解。此外，水體環境中喹諾酮類抗生素能通過吸附作用蓄積于沉積物中（孟磊等，2015）。以往關于水庫環境中抗生素的研究表明，喹諾酮類抗生素平均濃度低于四環素和大環內酯類抗生素（廖杰等，2020）。因此，水庫中喹諾酮較低的含量可能是導致相應 ARB豐度較低的重要因素。與上覆水相比，沉積物四環素類抗生素占比增高，這可能和沉積物對四環素有較強的吸附性能有關。土壤對四環素類抗生素的吸附能力和吸附容量高于其他類別的抗生素（伊麗麗等，2013），導致沉積物中ARB豐度相應增加。

2.2 沉積物和上覆水中耐藥菌的豐度關系

由圖2可知，本研究選取的ARB在大部分采樣點均能檢出，且當ARB在水庫上覆水中檢出時，其在沉積物中也往往能被檢出。該結果表明，上覆水與沉積物 ARB的賦存特征存在較強聯系。在此基礎上，本研究進一步采用了mantel分析評估了沉積物和上覆水中 ARB的豐度關系。結果表明，華中地區水庫型水源地沉積物和上覆水中 ARB豐度呈顯著性正相關（r=0.472，P=0.026，permutations=9999），表明水庫沉積物和上覆水ARB組成相似。沉積物是污染物的“匯”和“源”，包括ARB在內的污染物通過吸附、沉降等作用匯集在沉積物上（姜春霞等，2019）。當水體發生擾動時，吸附于沉積物中的污染物又重新釋放到上覆水中（張皓清等，2020）。相對于河海等環境介質，湖庫環境水體流動相對緩慢，沉積物和水交換能力也相對較弱。但湖庫有增強水和沉積物之間物質交換的途徑。本研究樣品采集工作于10月及11月進行，晝夜溫差較大，因此易造成“翻湖”現象，該途徑能夠增強水和沉積物之間的物質交換（陸桂華等，2009）。

本研究通過 Spearman相關性分析探索了不同類別ARB的共現關系，結果如圖3所示。結果表明，多數耐藥菌之間都具有一定的正相關關系。其中四環素類ARB及氨基糖苷類ARB均與三類耐藥基因有顯著性正相關。有研究表明，中國往往采用數種抗生素聯用的方式治療疾病（Qiao et al.，2018）。因此，環境中不同種類抗生素的共選擇作用是不同類別ARB豐度具有相關性的因素之一。

圖3 不同類別ARB的共現關系Fig.3 Co-occurrence patterns among different ARB types

2.3 菌種鑒定結果

本研究根據細菌形態的不同，選取了 26 個菌株進行菌種鑒定，共鑒定出8種菌屬。其中氣單胞菌屬（Aeromonas，9株，34.6%）及不動桿菌屬（Acinetobacter，7株，26.9%）檢出率最高。此外，腸桿菌屬（Enterobacter）、芽孢桿菌屬（bacillus）以及假單胞菌屬（Pseudomonas）均檢出2株；希瓦氏菌屬（Shewanella）、紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis）以及類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）均檢出1株。氣單胞菌屬、不動桿菌屬以及芽孢桿菌屬均為人體條件致病菌，在人體免疫力下降時能夠引起人體胃腸道、肺部感染（葉繁等，2019）。本研究篩選的氣單胞菌屬及不動桿菌屬均對3種以上抗生素有抗性，這兩種菌屬的多重抗性可能會對人體健康產生威脅。此外，本研究還篩選出了能夠與人體腸道密切相關的腸桿菌屬細菌，兩株細菌均分離自沉積物中，表明水庫沉積物一定程度上受到糞源污染。兩株細菌分別對磺胺類抗生素及四環素類抗生素表現出耐藥性，表明陸源輸入也可能是導致水庫 ARB細菌廣泛分布的原因之一。

本研究同時對水樣和沉積物細菌總數（Total heterotrophic bacteria count，HPC）進行了計數（表2）。結果表明華中地區供水水庫 HPC低于山東省湖泊環境（錢巖等，2013）及華中地區非供水湖泊（孫增靈等，2011）中HPC數量。中國飲用水標準規定 HPC 總量不得超過 1.00×102CFUs·mL?1。以往研究表明，飲用水處理工藝對細菌的去除效果極為明顯（Zhang et al.，2020）。因此，雖然華中地區供水水庫受陸源輸入細菌影響，但華中地區水庫型水源地較少的細菌數量能夠在一定程度上保證飲用水水質。

表2 華中地區水庫上覆水和沉積物的總異養菌數Table 2 Total heterotrophic bacteria count of water supply reservoirs in central China

3 結論

（1）磺胺類和四環素類 ARB是華中地區水庫型水源地豐度最高的兩類ARB。

（2）華中地區水庫型水源地沉積物和上覆水中的ARB含量沒有顯著性差異。

（3）華中地區水庫型水源地多數耐藥菌之間具有一定的共現關系。

（4）水庫型水源地的一些條件致病菌具有3種以上多重抗性，由此導致的潛在風險值得關注。