無機(jī)砷短期脅迫對(duì)銅藻幼苗氧化損傷、抗氧化酶及抗氧化物的影響

張鵬，劉瑋，王鐵桿，鐘晨輝，陶月良

1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所/浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325000；2.山東省海洋生物研究院藻類研究中心，山東 青島 266104；3.福建省水產(chǎn)研究所/福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361000；4.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325000

砷污染是目前世界關(guān)注重要環(huán)境問題，其來源主要為礦業(yè)采掘、農(nóng)藥施用及化石燃料等途徑（Basu et al.，2001）。砷污染的危害較為深遠(yuǎn)，砷化物不僅本身具有一定毒性（朱濛等，2020），而且其能在生物體內(nèi)積累，并可通過食物鏈傳遞、富集，從而產(chǎn)生廣泛危害（Nakajima et al.，2010；杜森等，2019；趙寧寧等，2019）。目前中國是受砷污染較為嚴(yán)重的國家之一，地表水體被砷污染的現(xiàn)象較為突出（楊婉玲等，2015），經(jīng)由地表徑流，近岸海域也是受砷污染影響的重要區(qū)域（胡立成等，2017）。在近岸海域分布的大型海藻體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)有砷富集現(xiàn)象，尤其在墨角藻目海藻中無機(jī)砷積累較為明顯（Koch et al.，2007；楊承虎等，2017），這表明大型海藻對(duì)砷脅迫具有一定耐受性。通常砷脅迫會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)嚴(yán)重的過氧化損傷，這不僅會(huì)激活生物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)應(yīng)對(duì)脅迫產(chǎn)生的過量活性氧（Basu et al.，2001；Flora，2011），而且在植物中以NPT為代表的抗氧化物能夠絡(luò)合砷離子，通過絡(luò)合物轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)隔，以減輕脅迫效應(yīng)（史靜等，2015；馬思思等，2020）。但在大型海藻中無機(jī)砷脅迫能對(duì)藻體產(chǎn)生何種影響，且藻體如何應(yīng)對(duì)無機(jī)砷脅迫目前并不清楚。

銅藻（Sargassum horneri）隸屬于褐藻門、墨角藻目、馬尾藻科，是近岸海藻場(chǎng)構(gòu)建的重要種類。近年來隨著漂浮銅藻的出現(xiàn)，針對(duì)銅藻提取物體外抗氧化活性相關(guān)研究逐漸受到關(guān)注（袁付紅等，2019；張玉等，2018；鄭麗杰等，2020），但對(duì)于銅藻體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的研究相對(duì)較少。有研究發(fā)現(xiàn)相較于海帶、裙帶等大型海藻，銅藻能夠富集更高濃度的無機(jī)砷（陳露等，2020），但在砷脅迫條件下銅藻抗氧化系統(tǒng)的脅迫應(yīng)對(duì)機(jī)制并不清楚。因此以銅藻為目標(biāo)海藻開展砷脅迫條件下的生理研究，有利于深入了解大型海藻應(yīng)對(duì)外源砷脅迫的抗逆生理特點(diǎn)。本研究以銅藻為研究對(duì)象，探討了不同價(jià)態(tài)、濃度的無機(jī)砷（As3+、As5+）短期脅迫下，海藻體內(nèi)氧化損傷、抗氧化酶及抗氧化物等生理指標(biāo)的響應(yīng)情況，為揭示銅藻砷脅迫下抗氧化系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品為人工繁育的銅藻幼苗，種菜來自浙江南麂島（27°27′N，121°03′E）。幼苗在室內(nèi)懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度18 ℃，光照強(qiáng)度2400 lx，光照周期為光照12 h，黑暗12 h。培養(yǎng)基采用鹽度30的滅菌海水配制的PES培養(yǎng)基，每5天更換1次培養(yǎng)液。選取藻體長(zhǎng)度3 cm的健康幼苗用于試驗(yàn)。

1.2 砷濃度實(shí)驗(yàn)組設(shè)置

砷濃度實(shí)驗(yàn)組分為As3+和As5+實(shí)驗(yàn)組，在培養(yǎng)基中分別添加NaAsO2、Na2HAsO4·7H2O獲得As3+和As5+的濃度梯度實(shí)驗(yàn)組。鑒于銅藻砷富集能力較強(qiáng)（陳露等，2020），為獲得銅藻砷脅迫下的半效應(yīng)濃度本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)置了較高的砷脅迫濃度，As3+和As5+的濃度梯度分別設(shè)置為0、50、100、150、200 mmol·L?1。將實(shí)驗(yàn)藻體用滅菌海水沖洗后，分別轉(zhuǎn)入帶有2 L培養(yǎng)基的3 L的三角瓶中進(jìn)行充氣懸浮培養(yǎng)；各實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含30株幼苗。藻體脅迫處理24 h后取出，先用滅菌海水沖洗，再用去離子水反復(fù)沖洗，待拭干藻體表面水分后，進(jìn)行后續(xù)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

以相對(duì)電導(dǎo)率為指標(biāo)衡量銅藻幼苗細(xì)胞損傷率。RC測(cè)定時(shí)稱取0.5 g海藻幼苗，放入帶有15 mL去離子水（電導(dǎo)率<0.1 US·cm?1）的試管中，18 ℃下，在 200 r·min?1的搖床上振蕩 2 h，隨即測(cè)定溶液電導(dǎo)率 C1。隨后沸水浴 30 min，再在 200 r·min?1的搖床上振蕩 2 h，待冷卻至 18 ℃后測(cè)定溶液電導(dǎo)率C2，設(shè)置3次重復(fù)。相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式如下：

氧化損傷指標(biāo)（OFR、MDA）、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）及抗氧化物含量（GSH、NPT）的測(cè)定使用上海酶聯(lián)生物公司的相關(guān)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定時(shí)取 0.2 g藻體液氮研磨后作為待測(cè)樣品進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

不同砷濃度實(shí)驗(yàn)組比較采用單因素方差分析，其組間比較采用LSD法，不同價(jià)態(tài)砷實(shí)驗(yàn)組比較采用t檢驗(yàn)，顯著性水平為α=0.05。方差分析及主成分分析過程由SPSS Statistics 23.0軟件完成，銅藻幼苗半效應(yīng)濃度（EC50）采用Logistic方程法（段美紅等，2020）計(jì)算獲得，對(duì)相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)據(jù)進(jìn)行Logistic非線性擬合，其擬合方程為：

式中，y為相對(duì)電導(dǎo)率值代表細(xì)胞傷害率；x為實(shí)驗(yàn)組砷濃度；a為細(xì)胞傷害率飽和量，b、k為方程系數(shù)。半效應(yīng)濃度（EC50）計(jì)算公式為：

2 結(jié)果

2.1 砷脅迫下相對(duì)電導(dǎo)率變化及半效應(yīng)濃度的確定

不同濃度砷脅迫下藻體電導(dǎo)率變化如圖 1所示，隨著砷濃度增加藻體電導(dǎo)率顯著提高（P=0.000，α<0.05，下同）。As3+實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)濃度由 50 mmol·L?1升高至 200 mmol·L?1時(shí)，藻體相對(duì)電導(dǎo)率由(54.5%±5.0%) 提高至 (95.5%±3.5%)；同樣在 As5+實(shí)驗(yàn)組中，藻體相對(duì)電導(dǎo)率也由 (32.4%±3.8%) 逐漸提高至 (91.4%±3.7%)。總體上，不同價(jià)態(tài)砷實(shí)驗(yàn)組的電導(dǎo)率差異不顯著。但兩兩比較發(fā)現(xiàn)，在 50 mmol·L?1及 100 mmol·L?1濃度時(shí)不同價(jià)態(tài)砷實(shí)驗(yàn)組間 存 在 顯 著 差 異 （ 50 mmol·L?1P=0.007 ， 100 mmol·L?1P=0.001），且 As3+實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)電導(dǎo)率高于As5+實(shí)驗(yàn)組。

圖1 不同濃度砷脅迫下銅藻相對(duì)電導(dǎo)率Fig.1 Relative conductivity changes of S.horneri under different concentrations of arsenic stress

分別對(duì)不同價(jià)態(tài)砷實(shí)驗(yàn)組電導(dǎo)率進(jìn)行 Logistic曲線擬合（圖 2），其中 As3+實(shí)驗(yàn)組曲線回歸系數(shù)（r2=0.757）優(yōu)于 As5+實(shí)驗(yàn)組曲線回歸系數(shù)（r2=0.661）。曲線分析發(fā)現(xiàn)，在 0—100 mmol·L?1濃度區(qū)間時(shí)，As3+實(shí)驗(yàn)組相對(duì)電導(dǎo)率迅速上升，而As5+實(shí)驗(yàn)組相對(duì)電導(dǎo)率則上升相對(duì)遲緩；在 100—200 mmol·L?1濃度區(qū)間時(shí)，As3+實(shí)驗(yàn)組相對(duì)電導(dǎo)率已達(dá)到平臺(tái)期，而 As5+實(shí)驗(yàn)組相對(duì)電導(dǎo)率仍呈上升趨勢(shì)。As5+實(shí)驗(yàn)組 EC50值為 116.3 mmol·L?1，而 As3+實(shí)驗(yàn)組 EC50值僅為 50.1 mmol·L?1，兩者比值為2.3∶1。

圖2 銅藻相對(duì)電導(dǎo)率的Logistic擬合曲線Fig.2 Logistic fitting curves based on relative conductivity of S.horneri

2.2 砷脅迫下OFR與MDA變化

砷濃度對(duì)銅藻 OFR產(chǎn)生速率影響顯著（P=0.000）（圖3），As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組的 OFR產(chǎn)生速率均隨砷濃度上升而提高。對(duì)比不同價(jià)態(tài)砷實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，雖然As3+實(shí)驗(yàn)組OFR產(chǎn)生速率比As5+實(shí)驗(yàn)組更早到達(dá)平臺(tái)期，但不同價(jià)態(tài)砷實(shí)驗(yàn)組OFR產(chǎn)生速率總體差異未達(dá)到顯著水平（P=0.196），且相同濃度下As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組差異也不明顯。

圖3 不同砷濃度下銅藻OFR和MDA變化情況Fig.3 Variation of OFR and MDA in S.horneri under different concentrations of arsenic

藻體內(nèi) MDA含量受砷脅迫濃度變化明顯（P=0.000）。As3+實(shí)驗(yàn)組隨砷濃度上升，MDA含量迅速提高并在100 mmol·L?1濃度時(shí)達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)；As5+實(shí)驗(yàn)組MDA含量隨砷濃度上升較為遲緩，在 150 mmol·L?1時(shí) MDA 含量才達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組MDA含量最大值均出現(xiàn)在200 mmol·L?1時(shí)，但差異并不明顯（P=0.125）。雖然在50 mmol·L?1及 100 mmol·L?1濃度時(shí) As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組MDA含量存在明顯差異（50 mmol·L?1P=0.011，100 mmol·L?1P=0.004），但總體上不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組MDA含量差異未達(dá)到顯著水平（P=0.274）。

2.3 砷脅迫對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)的影響

砷脅迫濃度對(duì) SOD活性產(chǎn)生了明顯影響（P=0.000）（圖4）。As3+實(shí)驗(yàn)組隨著砷濃度上升SOD活性首先顯著上升，并在As3+100 mmol·L?1時(shí)達(dá)到酶活最大值 (25.6±2.1) U·g?1，隨后 SOD 活性隨砷濃度上升呈不明顯的下降趨勢(shì)。As5+實(shí)驗(yàn)組在 0—150 mmol·L?1范圍時(shí)，SOD活性隨砷濃度上升而持續(xù)升高；150—200 mmol·L?1范圍時(shí)，SOD 活性變化并不明顯（P=0.850）。砷脅迫濃度對(duì)POD活性的影響也達(dá)到顯著水平（P=0.000），在 0—100 mmol·L?1范圍時(shí)，隨砷濃度上升 As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組POD 活性均明顯提高；在 100—200 mmol·L?1范圍時(shí)，As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組POD活性變化均不顯著。不同于SOD和POD，CAT活性對(duì)砷脅迫濃度變化并未產(chǎn)生明顯響應(yīng)（P=0.270）。

圖4 不同砷濃度下SOD、POD和CAT的活性變化Fig.4 Activities of SOD,POD and CAT varied in S.horneri under different concentrations of arsenic

對(duì)不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，100 mmol·L?1濃度時(shí)As3+實(shí)驗(yàn)組SOD活性、POD活性均明顯高于As5+實(shí)驗(yàn)組酶活性（SOD P=0.000，POD P=0.000），但總體上不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組SOD、POD、CAT活性差異均不明顯（SOD P=0.087，POD P=0.218，CAT P=0.777）。

2.4 砷脅迫下GSH和NPT變化

GSH含量、NPT含量均受砷脅迫濃度顯著影響（圖 5），在 0—50 mmol·L?1范圍時(shí)，As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組GSH含量與NPT含量均隨砷脅迫濃度增加而顯著上升。在 50—150 mmol·L?1范圍時(shí)，As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組 GSH含量變化并不明顯，As5+實(shí)驗(yàn)組 NPT含量變化也不顯著，但 As3+實(shí)驗(yàn)組 NPT含量呈下降趨勢(shì)，且（As3+）150 mmol·L?1時(shí) NPT 含量明顯低于（As3+）50 mmol·L?1時(shí)的值（P=0.011）。在 50—150 mmol·L?1范圍時(shí)，As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組 GSH 含量與NPT含量雖有下降趨勢(shì)，但變化并不顯著。

圖5 不同砷濃度下GSH和NPT的濃度變化Fig.5 Variations of GSH and NPT content in S.horneri under different concentrations of arsenic

相同砷濃度時(shí)不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組兩兩對(duì)比發(fā)現(xiàn)，GSH含量均無明顯差異，NPT含量?jī)H在砷脅迫濃度為 50 mmol·L?1時(shí)存在明顯差異（P=0.021）。GSH 含量、NPT含量各自在不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組間總體差異不顯著。

2.5 抗氧化指標(biāo)主成分分析及綜合排序

對(duì)所有實(shí)驗(yàn)組的5個(gè)抗氧化生理指標(biāo)（SOD、POD、CAT、GSH、NPT）進(jìn)行主成分分析，共提取到2個(gè)主成分，其貢獻(xiàn)率分別為55.325%、29.535%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)84.860%，且兩個(gè)主成分特征值均大于1。兩個(gè)主成分表達(dá)式分別為：

Y1、Y2為主成分，x1、x2、x3、x4、x5分別代表SOD、POD、CAT、GSH、NPT的標(biāo)準(zhǔn)化值。主成分1中NPT、GSH、POD、SOD的系數(shù)較大，是反映抗氧化物（NPT、GSH）和抗氧化酶（POD、SOD）的綜合指標(biāo)；主成分2中CAT的系數(shù)較大，主要反映了CAT指標(biāo)。通過貢獻(xiàn)率對(duì)主成分值加權(quán)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組銅藻抗氧化綜合得分情況進(jìn)行排序，結(jié)果見表1。排名前 3 位的是實(shí)驗(yàn)組為（As5+）100 mmol·L?1、（As3+）50 mmol·L?1、（As5+）150 mmol·L?1。在 As3+實(shí)驗(yàn)組中，隨著濃度的升高，銅藻抗氧化綜合得分呈下降趨勢(shì)；而在As5+實(shí)驗(yàn)組中，隨著濃度的升高，銅藻抗氧化綜合得分則呈先上升后下降趨勢(shì)。

表1 砷脅迫實(shí)驗(yàn)組抗氧化綜合得分排序Table 1 Ranking arsenic stress treatments with antioxidant comprehensive score

3 討論

3.1 砷脅迫對(duì)銅藻細(xì)胞損傷的影響

砷作為一種植物非營養(yǎng)元素本身具有一定的生物毒性并可在海藻體內(nèi)富集（Nakajima et al.，2010；陳露等，2020），并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種氧化損傷影響正常生長(zhǎng)（Rao et al.，2004；Flora，2011）。砷脅迫條件下可誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的活性氧（Hei et al.，2004），由此導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化損傷，其中MDA不僅是膜脂中不飽和脂肪酸的過氧化產(chǎn)物，還是反映脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)（陳貴等，1991；Cooper et al.，2009）。當(dāng)具有通路作用的細(xì)胞膜脂質(zhì)損傷加劇后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞透性變化，甚至細(xì)胞膜破損、胞質(zhì)流出造成細(xì)胞死亡（Ferreri et al.，2007；范寧波等，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，不同價(jià)態(tài)的砷脅迫均能導(dǎo)致銅藻體內(nèi) OFR產(chǎn)生速率提高，且 As3+、As5+砷脅迫濃度對(duì)藻體內(nèi) OFR產(chǎn)生速率具有顯著影響，這與在其他物種中的研究結(jié)果類似（Luna et al.，2010）；As3+、As5+砷脅迫均能明顯促使銅藻體內(nèi) MDA含量上升，這與在大豆、香蒲（Typha angustifolia L.）等植物中研究結(jié)果一致（胡家恕，1995；陳天等，2020）。在As3+、As5+砷脅迫條件下，伴隨著銅藻體內(nèi) OFR產(chǎn)生速率及 MDA含量的上升，藻體的相對(duì)電導(dǎo)率也明顯提高，其中 200 mmol·L?1時(shí) As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組的藻體相對(duì)電導(dǎo)率較對(duì)照組 0 mmol·L?1分別提高了 4.2、4.0倍，這表明在實(shí)驗(yàn)濃度下不同價(jià)態(tài)的砷脅迫均對(duì)銅藻幼苗產(chǎn)生了明顯的細(xì)胞損傷。由于本研究選取的砷脅迫濃度較高，As3+、As5+實(shí)驗(yàn)組的銅藻幼苗均受到嚴(yán)重細(xì)胞損傷，因此不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組在相對(duì)電導(dǎo)率、OFR產(chǎn)生速率及MDA含量等指標(biāo)總體差異不顯著，但在50、100 mmol·L?1低濃度實(shí)驗(yàn)組不同價(jià)態(tài)的砷脅迫對(duì)藻體產(chǎn)生的脅迫效果并不一致，As3+實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量明顯高于 As5+實(shí)驗(yàn)組。不同價(jià)態(tài)砷脅迫EC50對(duì)比發(fā)現(xiàn)，As5+EC50值為As3+EC50值的2.3倍，綜合低濃度砷脅迫實(shí)驗(yàn)組相對(duì)電導(dǎo)率、MDA含量差異，我們認(rèn)為在 50—100 mmol·L?1濃度范圍內(nèi)As3+相較于 As5+對(duì)銅藻幼苗產(chǎn)生的脅迫效應(yīng)更強(qiáng)，這在動(dòng)物的相關(guān)研究中也有類似發(fā)現(xiàn)（Basu et al.，2001）。

3.2 砷脅迫對(duì)銅藻抗氧化系統(tǒng)的影響

抗氧化酶與抗氧化物共同組成了生物體的抗氧化系統(tǒng)，并在應(yīng)對(duì)外界脅迫產(chǎn)生的氧化損傷中發(fā)揮重要作用（Sanità di Toppi et al.，2008）。SOD 能將 OFR轉(zhuǎn)化為 H2O2，而 POD、CAT則進(jìn)一步將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O（馬思思等，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著砷脅迫濃度的增加，銅藻中SOD、POD的酶活性明顯升高，但CAT酶活性則變化不明顯。這與重金屬脅迫下大葉井口邊草（Pteris cretica var.nervosa）、中國蓮（Nelumbo nucifera）及梭魚草（Pontederia cordata）等植物中的SOD、POD活性變化趨勢(shì)較為一致（樊香絨等，2013；胡擁軍等，2015；馬思思等，2020），這表明銅藻可通過 SOD與POD協(xié)同作用消除非生物脅迫下產(chǎn)生的活性氧。然而也有研究發(fā)現(xiàn)，SOD與CAT可協(xié)同減輕半葉馬尾藻（Sargassum hemiphyllum）的鎘脅迫效應(yīng)（葉鵬浩等，2019），這可能是由于不同海藻種類的抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)不同重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制存在差異而導(dǎo)致的結(jié)果。NPT能與游離態(tài)重金屬絡(luò)合消除或降低重金屬造成的氧化損傷（原海燕等，2013），且有研究發(fā)現(xiàn) As5+脅迫能明顯提高煙草（Nicotiana tabacum）、桐花樹（Aegiceras corniculatum）幼苗中NPT含量（Wojas et al.，2010；吳桂容等，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)，在銅藻中不僅As5+脅迫能促使NPT含量上升，而且As3+脅迫也具有類似效果。GSH在植物緩解砷脅迫的過程中發(fā)揮著重要的抗氧化作用（Pu et al.，2014；吳桂容等，2016），但是GSH會(huì)隨著脅迫作用的加劇而逐漸被消耗（Bankaji et al.，2015；芮海云等，2018）。我們發(fā)現(xiàn)銅藻幼苗為應(yīng)對(duì)砷脅迫會(huì)提升藻體 GSH含量，且隨著脅迫濃度的增加藻體內(nèi)GSH含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。總之，砷脅迫濃度對(duì)銅藻抗氧化系統(tǒng)中抗氧化酶（SOD、POD）和抗氧化物（GSH、NPT）影響較為明顯。

不同價(jià)態(tài)的砷脅迫對(duì)銅藻抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生的影響并不完全一致。本研究選取了較高的砷脅迫濃度，由于銅藻幼苗受到較強(qiáng)的氧化損傷，因而總體上不同價(jià)態(tài)砷脅迫對(duì)抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生的差異并不顯著。但不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組兩兩比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在較低砷濃度范圍（50—100 mmol·L?1）和高濃度范圍（150—200 mmol·L?1）時(shí)，不同價(jià)態(tài)實(shí)驗(yàn)組的部分抗氧化系統(tǒng)生理指標(biāo)存在顯著差異。如50 mmol·L?1時(shí)As3+實(shí)驗(yàn)組的 NPT含量明顯高于 As5+實(shí)驗(yàn)組；100 mmol·L?1時(shí) As3+實(shí)驗(yàn)組的 SOD、POD 活性明顯高于 As5+實(shí)驗(yàn)組；相較于 100 mmol·L?1As3+實(shí)驗(yàn)組，200 mmol·L?1As3+實(shí)驗(yàn)組的 GSH 含量、NPT 含量顯著降低，但As5+實(shí)驗(yàn)組的GSH含量、NPT含量降低并不明顯。

3.3 銅藻抗氧化系統(tǒng)的主成分分析

我們對(duì)銅藻抗氧化系統(tǒng)中SOD、POD、CAT、GSH、NPT等抗氧化生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取到兩個(gè)主成分Y1和Y2，其中Y1貢獻(xiàn)率達(dá)到55.3%，是Y2貢獻(xiàn)率的1.9倍。在Y1中，NPT、GSH、SOD、POD均具有較高的貢獻(xiàn)系數(shù)，這表明NPT、GSH、SOD、POD在銅藻抗氧化過程中起到了重要作用。這與隨著砷脅迫濃度的增加銅藻中的抗氧化酶（SOD、POD）酶活及抗氧化物（GSH、NPT）的含量上升的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。從圖6可以看出，GSH、NPT的向量方向及長(zhǎng)度較接近，這表明兩種抗氧化物對(duì)各砷脅迫實(shí)驗(yàn)組具有相似影響，同理 SOD、POD也對(duì)各實(shí)驗(yàn)組具有相似影響；但GSH、NPT與SOD、POD的向量方向卻不相同，這表明抗氧化物（GSH、NPT）與抗氧化酶（SOD、POD）對(duì)各砷脅迫實(shí)驗(yàn)組的影響存在差異。對(duì)低濃度實(shí)驗(yàn)組（As3+50 mmol·L?1；As5+100 mmol·L?1）而言，抗氧化物（NPT、GSH）發(fā)揮主導(dǎo)作用；而對(duì)高濃度實(shí)驗(yàn)組（As3+100 mmol·L?1；As5+200 mmol·L?1），抗氧化酶（SOD、POD）則發(fā)揮主導(dǎo)作用。這與鎘脅迫下地衣（Trebouxia impressa）的生理研究結(jié)果類似（Sanità di Toppi et al.，2008），即當(dāng)鎘脅迫濃度較低時(shí)，以NPT為代表的抗氧化物起主要防御作用，而當(dāng)鎘脅迫濃度較高時(shí)，NPT類的抗氧化物下降，以抗氧化酶及脅迫蛋白發(fā)揮主要防御作用。

圖6 銅藻抗氧化系統(tǒng)PCA分析Fig.6 PCA analysis of antioxidant system in S.horneri

基于主成分對(duì)各砷脅迫濃度實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行抗氧化綜合得分計(jì)算并排序。結(jié)果表明隨砷脅迫濃度升高，As3+實(shí)驗(yàn)組抗氧化綜合得分持續(xù)降低，而As5+實(shí)驗(yàn)組抗氧化綜合得分則先升高后下降。我們發(fā)現(xiàn)臨近 EC50的砷脅迫實(shí)驗(yàn)組傾向具有較高的抗氧化綜合分值，由此推斷過度的細(xì)胞氧化損傷是導(dǎo)致抗氧化綜合分值下降的重要原因，而抗氧化綜合分?jǐn)?shù)的變化一定程度上也反映了銅藻幼苗抗氧化系統(tǒng)對(duì)砷脅迫的響應(yīng)。隨著砷濃度提高，脅迫壓力增加，藻體內(nèi)抗氧化酶活性及抗氧化物含量相應(yīng)上升，使得抗氧化綜合分值升高；當(dāng)砷濃度過高時(shí)，藻體細(xì)胞氧化損傷加劇，部分細(xì)胞死亡，使得藻體內(nèi)抗氧化酶活性及抗氧化物含量降低，導(dǎo)致抗氧化綜合得分降低。由于As3+EC50較低，相對(duì)較低的As3+脅迫濃度即能造成較為嚴(yán)重的氧化損傷，因此As3+實(shí)驗(yàn)組抗氧化綜合得分隨砷濃度升高持續(xù)降低；As5+EC50較高，因此As5+實(shí)驗(yàn)組抗氧化綜合得分隨砷濃度升高先升高，待砷濃度大于100 mmol·L?1時(shí)，細(xì)胞氧化損傷加劇，導(dǎo)致As5+實(shí)驗(yàn)組抗氧化綜合得分出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

4 結(jié)論

As3+、As5+脅迫均能誘導(dǎo)銅藻幼苗產(chǎn)生氧化損傷，但銅藻As3+EC50的值僅為As5+EC50的43.5%。隨著As3+、As5+砷脅迫濃度的上升，銅藻OFR產(chǎn)生速率、MDA含量及藻體相對(duì)電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，為了減輕砷脅迫造成的氧化損傷，抗氧化酶（SOD、POD）活性和抗氧化物（GSH、NPT）含量也相應(yīng)提高，但隨著氧化損傷加劇，抗氧化物（GSH、NPT）含量出現(xiàn)不同程度的降低。砷脅迫濃度對(duì)氧化損傷指標(biāo)（OFR產(chǎn)生速率、MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率）、抗氧化酶（SOD、POD）活性和抗氧化物（GSH、NPT）含量均有顯著影響。主成分分析表明，在較低濃度砷脅迫下，藻體抗氧化系統(tǒng)傾向于抗氧化物（GSH、NPT）；而在較高濃度砷脅迫時(shí)，藻體抗氧化系統(tǒng)傾向于抗氧化酶（SOD、POD）。砷脅迫濃度過高，可導(dǎo)致藻體氧化損傷進(jìn)一步加劇，部分細(xì)胞的損傷死亡則減弱了藻體抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)。