堿處理對聚ε-己內酯納米纖維膜蛋白吸附性能的影響

梅倩倩 曾羽佳 王君碩 李 彥 王 璐

1.東華大學 紡織學院(中國) 2.東華大學 紡織面料技術教育部重點實驗室(中國) 3.東華大學 紡織行業生物醫用紡織材料與技術重點實驗室(中國)

醫用紡織材料近年來發展迅速，它是融合了紡織、材料、生物、醫學等交叉學科的一類紡織材料，具有其他生物材料無法企及的結構優勢，如何不斷優化這類紡織材料與生物體間的相互作用既是最早又是最受關注的學術課題。由于醫用材料與血液或體液接觸時，首先是與蛋白質作用，隨后再引發其它的活化反應，因此根據應用導向來調控紡織材料表面的蛋白吸附性能是十分重要的。例如，對于植入性醫用紡織材料而言，可通過調控蛋白質吸附性能介導引發細胞以及其他生物活性分子的行為[1-2]。對于體外診斷用醫用紡織材料而言，設計構筑可特異性結合特定蛋白的表面[3](如借助抗原-抗體、生物素-親和素、配體-受體系統)或吸附具有催化效能的蛋白質，可實現對靶標物質的篩選或識別[4]。因此，探究醫用紡織材料表面的蛋白吸附性能的調控方法與準則已成為生物醫用紡織材料的研究重點。

聚ε-己內酯(PCL)是一種脂肪酸酯，無毒且熔點低，與常見的可降解聚合物聚羥基乙酸或聚乳酸相比，降解速度慢，因此適合選做長期植入用材料[5-7]。基于PCL構建的醫用紡織材料也層出不窮，如利用具有完全互連的孔隙網絡的三維多孔PCL支架用于骨缺損重建[8-9]；利用3D打印技術制備不同外形的PCL纖維支架用于軟骨組織修復[10]；通過熔融共混法與熱擠出工藝構建人工心臟瓣膜[11]；浸漬凍干法制備得到的PCL與膠原復合薄膜構建的多孔支架用于皮膚組織重建[12]；靜電紡絲法制備的PCL納米纖維基支架可用于心臟瓣膜、神經、血管等組織工程的修復[13-14]。PCL基醫用紡織品的不足之處也在應用中顯現出來，由于其結晶性強且親水性差，從而限制了其在生物醫用領域的進一步應用[2，15]。為了改善PCL納米纖維材料的親水性，物理浸涂、化學共混等方法相繼被采用，如Lancuski等[16]通過與半乳糖修飾的PCL共混制備親水性納米纖維材料，但生物大分子半乳糖的參與增加了紡絲參數的調控難度，而且這些修飾方法反應流程復雜，不利于操作。

靜電紡絲膜片具有孔隙率高、比表面積大等特點，可形成三維網狀結構，有利于提高生物大分子的負載效率、促進細胞增殖分化，應用前景廣闊。因此，本研究以靜電紡絲技術制備高比表面積的PCL納米纖維膜作為目標材料，采用氫氧化鈉(NaOH)直接處理膜表面，并用乙醇對其進行親水改性，隨后在不同濃度處理條件下，以牛血清蛋白(BSA)為吸附對象，探究改性處理后PCL納米纖維膜的表面形貌、力學性能、潤濕性及其對蛋白質的吸附性能的變化規律，該種高蛋白吸附性能的膜材料有望在生物醫學領域得到廣泛的應用。

1 試驗部分

1.1 原料與儀器

試驗原料：PCL(Mn=80 000)，美國Sigma-Aldrich有限公司；三氯甲烷(CHCl3)；甲醇(CH3OH)，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司；無水乙醇(C2H6O)，NaOH，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)，BSA，上海生物工程有限公司。

試驗儀器：靜電紡絲設備，深圳市通力微納科技有限公司；X5-2S型恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；電子天平，丹佛儀器北京有限公司；真空干燥箱，上海實驗儀器總廠；電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SU 8010型場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)，日本Hitachi；臺式測厚儀，上海添時科學儀器有限公司；光學接觸角測量儀，德國Dataphysics；電子單纖維強力儀，萊州市電子儀器有限公司；Nicolet 6700型傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)，美國Thermo Fisher；TV-1901型紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試樣與制備

1.2.1 PCL靜電紡納米纖維膜的制備

配制質量分數為15%的均一、穩定、透明的PCL紡絲溶液，使用10 mL注射器和20 G金屬針頭，在紡絲電壓為21 kV，紡絲速度為1.5 mL/h，接收距離為23 cm，環境溫度為24～26 ℃，相對濕度為44%～46%條件下制備PCL納米纖維膜，在襯有鋁箔的平板接受裝置上收集納米纖維，并將制得的納米纖維膜在37 ℃真空干燥箱內干燥12 h。

1.2.2 PCL膜的堿處理改性

將納米纖維膜裁剪成3 cm×3 cm正方形，在體積分數為75%乙醇溶液中浸潤15 min，分別在不同濃度(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和6.00 mol/L)的NaOH溶液中反應(圖1)。將親水改性后的纖維膜用蒸餾水反復沖洗，放入真空干燥箱中37 ℃烘干備用。

圖1 PCL改性示意圖

1.3 結構表征與性能測試

PCL膜的力學性能測試：將納米纖維膜裁剪成3 mm×20 mm的測試條，采用電子單纖維強力儀測試樣品的力學性能，拉伸隔距為10 mm，拉伸速度為10 mm/min，預加張力0.5 N。測繪出試樣在拉伸變形過程中的拉伸應力-應變曲線，按式(1)計算斷裂強度。

σt=p/bd

(1)

式中：σt——斷裂強度，cN·mm-2

p——斷裂強力，cN；

b——試樣工作部分寬度，mm；

d——試樣工作部分厚度，mm。

1.4 蛋白質吸附性能研究

將BSA溶于PBS緩沖液中，配置成質量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5 mg/mL的溶液。使用紫外分光光度計在290 nm波長下測試吸光度值，并繪制BSA的濃度-吸光度曲線。

將樣品裁剪成直徑為14 mm的圓片，用PBS清洗3次，將試樣放入3 mL離心管中，加入3 mL濃度為1 mg/mL的BSA溶液，放置在37 ℃恒溫環境中培育12 h。

計算吸附量：用紫外分光光度計測試蛋白上清液的吸光度值，由標準曲線的回歸方程算出試樣吸附后蛋白上清液的蛋白濃度，由公式(2)計算得到單位面積試樣表面的蛋白吸附量。

Q=V(C0-C1)/S

(2)

式中：Q——單位面積試樣表面吸附的蛋白質量，mg/cm2；

C0——吸附前空白對照樣的蛋白質溶液的濃度，mg/mL；

C1——吸附試驗后裝有樣品的蛋白溶液的濃度，mg/mL；

V——離心管中蛋白溶液的體積，mL；

S——試樣表面積，cm2。

為了保證試驗結果的準確性，每個樣品設置3個平行樣。

2 結果與討論

2.1 PCL納米纖維膜的形貌分析

不同濃度NaOH對PCL納米纖維膜的形貌影響由圖2 所示。圖中可看出，PCL纖維表面光滑，纖維形態良好，經NaOH處理后，纖維表面出現溝槽，且隨著NaOH濃度升高，纖維表面溝槽增多，粗糙度增加。當NaOH濃度升高至6 mol/L時，纖維表面被嚴重刻蝕，纖維結構被破壞。

圖2 不同濃度NaOH處理1 h的PCL納米纖維膜的SEM圖

表1 不同濃度NaOH處理的PCL納米纖維膜厚度

PCL納米纖維膜中纖維的直徑變化如圖3所示，PCL纖維的平均直徑在改性過程中并未出現顯著的變化。

圖3 不同NaOH濃度處理的PCL納米纖維膜的纖維直徑

2.2 表面理化性能分析

納米纖維膜的改性原理如圖4所示，NaOH改性過程中，PCL大分子鏈上的酯基會水解產生親水性的羥基和羧基。

圖4 親水改性原理圖

圖5 NaOH改性處理前后PCL納米纖維膜的紅外圖譜

2.3 潤濕性分析

材料本身的潤濕性對NaOH的處理效果有極大的影響，通過模擬商用聚偏氟乙烯試紙的預處理步驟對PCL纖維膜進行乙醇預浸潤處理，改善待處理材料的浸潤性。乙醇預處理對納米纖維改性后潤濕性的影響如圖6所示。

圖6 經75%(體積分數)乙醇預浸潤與未浸潤的接觸角圖片

經乙醇預處理后再經NaOH改性的纖維膜的接觸角從137°降低至0°，而未經乙醇處理而直接通過NaOH改性的纖維膜的接觸角僅從137°降至106°，這說明經乙醇預浸潤處理可以明顯改善NaOH對纖維膜的親水改性效果。圖7為75%(體積分數)乙醇浸潤后經不同濃度NaOH處理的PCL納米纖維膜的接觸角。由圖可知，由于PCL材料本身的疏水性，PCL纖維膜的接觸角為137°，經NaOH改性后，其接觸角降低，當NaOH濃度上升至2 mol/L時，PCL納米膜的接觸角降為0°。

圖7 不同NaOH濃度處理的PCL纖維膜的接觸角

2.4 機械性能分析

PCL納米纖維膜具有豐富的孔道結構且纖維尺寸分布在微納米級，為了確保這種材料的機械性能符合組織工程支架的實際應用需求，需對PCL納米纖維膜進行力學性能評估。由圖8可知，經過堿處理后，PCL膜的應力減小，當濃度增加到6 mol/L時，纖維膜水解增大，拉伸過程中纖維膜出現脆斷，應力從19.1 MPa下降到4.01 MPa，斷裂伸長率從493.7%減小到18.27%，與PCL纖維形貌分析結果一致。因此，為兼顧納米纖維膜的良好機械性能與生物相容性，選擇NaOH處理濃度為0～4 mol/L的納米纖維膜來做最終蛋白質的吸附試驗。

圖8 不同濃度NaOH處理的PCL纖維膜的斷裂強度和斷裂伸長率

2.5 吸附性能分析

圖9為BSA質量濃度-吸光度標準曲線。由圖可知，曲線的標準回歸方程為y=0.26x+0.06，其中R2為0.994，大于0.99，表明方程具有良好的擬合度，可用作描述BSA蛋白的吸光度值與質量濃度之間的關系。

圖9 BSA質量濃度-吸光度值標準曲線圖

圖10為不同濃度NaOH處理的PCL納米纖維膜的蛋白吸附量圖，由圖可知0.5 mol/L濃度的NaOH處理的纖維膜的蛋白吸附性能最好。這是因為蛋白質的吸附機理不僅與蛋白質本身的結構與性質有關，還取決于材料表面的理化性質，如材料表面形態和表面能等。親水性材料能提高蛋白質從溶液到材料表面的遷移效率，但是材料的親水性又不利于蛋白質的黏附。然而不同濃度的NaOH處理提高了PCL基生物醫用纖維膜材料親水性的同時也對膜產生一定程度的刻蝕，由刻蝕形成的粗糙表面又有利于蛋白質吸附量的增加[17]。從其表面形貌圖(圖2)中可以看出，隨著NaOH濃度增大，膜表面遭受的刻蝕愈加嚴重，為了保證最佳的蛋白質吸附量，需要找到最優NaOH濃度，以使材料表面在親水性與粗造度的相互協調下達到最大的蛋白吸附量。最終試驗數據顯示，0.5 mol/L的NaOH處理能夠保證PCL納米纖維膜水解改性后達到最佳的蛋白吸附量，這是能夠保證膜在一定粗糙表面和親疏水作用相互配合下具有最大蛋白吸附量的NaOH濃度。

圖10 不同質量濃度NaOH處理的PCL納米纖維膜的BSA吸附量圖

3 結綸

通過靜電紡絲技術成功制備表面光滑且纖維形態良好的PCL納米纖維膜，NaOH改性處理使納米纖維膜表面水解產生親水性基團，乙醇預處理有助于改善親水性處理效果。改性處理過程中，NaOH濃度對纖維膜的形態結構、親疏水性與機械性能等影響顯著，濃度越高，纖維表面刻蝕越嚴重，機械性能有所損失。

BSA蛋白吸附試驗結果表明，采用0.5 mol/L濃度的NaOH處理纖維膜，能夠增加PCL納米纖維膜的親水性、提高表面粗糙度，該處理方法即有利于克服PCL基生物醫用纖維膜材料的親水性差的缺陷，又有利于蛋白質溶液潤濕PCL纖維膜，提升蛋白質的吸附量。