虎杖苷通過調控HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路對膿毒癥急性肺損傷的保護作用

孫鵬 陳敏 張細六 許愛軍

1.湖北工業大學醫院 武漢 430068 2.武漢市第九醫院 3.武漢市第五醫院 4.武漢同濟醫院

膿毒癥是一種因感染反應失調導致的、危及生命的器官功能障礙綜合征，是重癥加強護理病房（intensive care unit，ICU）住院患者最常見的死亡原因之一[1]。在膿毒癥患者中，約30%可發展為多器官功能障礙綜合征，其中肺部是最易受感染的器官之一，約40%的膿毒癥患者出現急性肺損傷（acute lung injury，ALI），并可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrme，ARDS）[2]。 目前治療ALI的藥物和方法有限，主要包括高流量鼻導管吸氧、無創通氣、俯臥位吸氧、體外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）、抗炎治療及相應的支持療法等，降低患者病死率的作用不明顯，因此尋找新的治療藥物是臨床治療膿毒癥相關ALI亟待解決的關鍵問題[3]。近年來，中藥及其活性成分在治療膿毒癥相關ALI方面表現出明顯優勢，具有多環節、多靶點整體調節的特點，有較好的應用前景[4]?；⒄溶眨╬olydatin，PD）是中藥虎杖的提取物，具有抗炎、抗氧化應激、降血脂、鎮咳、抗休克等藥理作用[5]。研究表明，PD對多種原因誘導的肺損傷具有保護和治療作用，但其作用機制尚不清楚[6-7]。高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）/Toll樣 受體4（Toll like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路是重要的炎癥相關信號轉導途徑，Sun等[8]研究證明，抑制HMGB1、TLR4、NF-κB等基因及其他細胞因子的表達水平可減輕敗血癥中重要器官的損傷。本研究通過盲腸結扎穿孔術制備大鼠膿毒癥ALI模型，以HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路為切入點，探究PD對膿毒癥ALI的保護作用及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD大鼠50只，6～8周齡，雌雄各半，體質量180～220g，購自河南省實驗動物中心[實驗動物生產許可證號碼：SCXK（豫）2017-0001]，飼養于河南省實驗動物中心實驗室獨立動物房[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（豫）2016-0002]，實驗動物及飼養條件符合《實驗動物管理條件》要求。飼養條件：室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，12h光暗照明，食水不限。實驗嚴格遵循替代 （replacement）、減少（reduction）、優化（refinement）的3R原則，給予實驗動物人道關懷。本研究的主體部分主要在湖北工業大學醫院完成，武漢市第九醫院、武漢市第五醫院、武漢同濟醫院共同參與完成了實驗樣本的檢測工作。研究方案獲湖北工業大學醫院倫理委員會批準（倫理委員會審批號碼：HBGYDXYY20200225）。

1.2 主要試劑與儀器 PD購于上海麥克林生化科技有限公司（批號：C10020672），使用時以0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na）溶解，并混合均勻；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司（批號：A001-3-2、A003-1-2）； 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒均購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司（批號：E-EL-M0049c、E-EL-M0037c、E-EL-M0044c）；HMGB1、TLR4、NF-κB p65、 甘 油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔源單克隆抗體和羊抗兔二抗均購于美國CST公司（批號：6893、14358S、8242、5174、7074）；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit購于美國Thermo Scientific公司（批號：K1622）；引物購于日本Takara公司（批號：RR420A）。DYCZ-24KS雙板垂直電泳儀購于北京六一儀器廠；7500聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀為美國Applied Biosystems公司產品；IX53顯微鏡購于日本奧林巴斯公司；G:BOX多功能凝膠成像系統為英國Syngene公司產品；Multiskan MK3酶標儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司；TGL16MB高速冷凍離心機購于長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 將50只大鼠隨機分為假手術組、模型組和PD高、中、低劑量組，每組10只。模型組和PD高、中、低劑量組大鼠采用盲腸結扎穿孔術制備膿毒癥ALI模型，具體操作參考文獻[9]的方法。大鼠提前禁食12h，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉，仰臥位固定于手術臺，腹部備皮、消毒，右下腹部作一2cm的切口，分離盲腸，在盲腸末端距離回盲部5mm處結扎，然后以20號針頭穿刺盲腸，每隔4cm穿刺1次，共3次，使盲腸形成創口，輕壓盲腸擠出少量腸內容物，最后回納盲腸，縫合腹腔。假手術組開腹后僅翻動盲腸后關腹，不進行結扎和穿刺。若造模后3～24h內大鼠出現豎毛、少尿、腹瀉、直腸溫度下降和眼角血性分泌物，則表明造模成功。經觀察，各組大鼠均造模成功，未出現死亡大鼠。

1.3.2 給藥方法 造模第2天開始給藥。PD高、中、低劑量組大鼠分別予以100、50、25mg·kg-1PD灌胃，藥物以濃度為0.5%的CMC-Na混合均勻；假手術組和模型組以等體積的CMC-Na灌胃，1次/d，連續7d。

1.3.3 ELISA法檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平 末次給藥后2h，大鼠腹主動脈穿刺取血，4℃靜置2h，3 000r/min離心10min，離心半徑為12.5cm，分離血清，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.4 各組大鼠肺組織濕干重比 （wet-to-dry weight ratio，W/D）檢測 末次給藥后2h，處死大鼠，分離右上肺葉，用于W/D檢測，其余肺組織一部分以4%多聚甲醛固定，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色；另一部分-80℃凍存，用于MDA水平和SOD活力檢測、實時定量聚合酶鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）及Western blot檢測。以吸水紙擦干肺組織表面水分后稱重，記為濕重（wet，W），隨后將肺組織放入80℃恒溫干燥箱烘干，24h后稱重，記為干重（dry，D），并計算W/D。

1.3.5 各組大鼠肺組織MDA水平及SOD活力檢測取-80℃凍存的大鼠肺組織，加入預冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS），冰上研磨勻漿，10 000r/min離心10min，離心半徑為12.5cm，取上清液-80℃保存。

1.3.5.1 SOD活力檢測 取待測樣品20μL，依次加入SOD檢測緩沖液、WST-8工作液和反應啟動工作液，37℃孵育30min，450nm波長檢測吸光度（absorbance，A）值，根據標準曲線計算待測樣品的SOD活力。

1.3.5.2 MDA水平檢測 取待測樣品100μL，加入工作液和蒸餾水，100℃水浴中孵育60min，冰浴冷卻，4 000r/min常溫離心10min，吸取200μL上清液加入玻璃比色皿中，分別檢測各樣品在波長450、532和600nm處的A值，ΔA450=A450測定-A450空白，ΔA532=A532測定-A532空白，ΔA600=A600測定-A600空白，MDA含量（nmol·mg-1）=5×[12.9×（ΔA532-ΔA600）-2.58×ΔA450]。

1.3.6 HE染色觀察大鼠肺組織病變 肺組織以4%多聚甲醛固定48h后，蒸餾水清洗，脫水、透明后4μm切片，脫蠟、復水后HE染色，400倍光鏡下觀察大鼠肺組織病理變化。

1.3.7 Real-time qPCR檢測肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達水平 取-80℃凍存的大鼠肺組織，冰上研磨，加入Trizol裂解液提取組織總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，按照說明書進行PCR擴增。 反應體系：dNTPs 0.5μL+5×Buffer 5μL+Taq 酶0.3μL+MgCl21.5μL+cDNA模板2μL+上下游引物各1μL，加去離子水至總體積25μL。反應條件：95℃5min，95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 30s，40個循 環 ，72℃延伸10min，4℃ 5min終止反應。實驗重復3次。采用2-△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達水平的變化。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3.8 Western blot檢測肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平 取-80℃凍存的大鼠肺組織，冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取肺組織蛋白，以二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 電 泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入HMGB1、TLR4和NF-κB p65兔源一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜，次日以含Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）清洗后加入羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶2 000），37℃孵育2h，洗膜，滴加發光液，置于凝膠成像系統顯影。以GAPDH為內參照，采用Image J軟件分析各個蛋白對應灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析 應用SPSS 25.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以±s表示，多樣本間比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較 造模后3～24h內，模型組和PD高、中、低劑量組大鼠均出現豎毛、少尿、腹瀉、直腸溫度下降現象，皮毛雜亂無光澤，眼角出現血性分泌物，表明造模成功。經過PD治療后，PD高、中劑量組大鼠豎毛、少尿、腹瀉情況明顯改善，皮毛恢復光澤，直腸溫度恢復正常，眼角血性分泌物減少；而PD低劑量組大鼠仍存在皮毛雜亂無光澤、少尿、腹瀉、直腸溫度低等體征，眼角仍可見明顯的血性分泌物。

2.2 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 各組間總體比較，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異有統計學意義（P＜0.01）。與假手術組比較，模型組、PD各劑量組大鼠血清上述炎癥因子水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，PD高、中劑量組大鼠上述血清炎癥因子水平降低（P＜0.05），PD低劑量組炎癥因子水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組炎癥因子水平均升高（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組炎癥因子水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in each group（±s，pg·mL-1）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較（±s，pg·mL-1）Tab.2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in each group（±s，pg·mL-1）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n TNF-α IL-1β IL-6假手術組 10 66.85±19.24 62.38±20.98 58.69±18.58模型組 10 320.14±23.96# 411.87±23.99# 398.76±20.57#PD 高劑量組 10 150.24±21.65#* 180.26±22.17#* 168.37±19.38#*PD 中劑量組 10 196.37±22.87#*▲ 208.39±21.56#*▲ 238.22±21.66#*▲PD 低劑量組 10 315.29±22.44#▲△ 400.65±23.54#▲△ 394.59±20.87#▲△F值 108.65 145.62 89.54 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組大鼠肺組織W/D值比較 各組間總體比較，肺組織W/D值差異有統計學意義（P＜0.01）。與假手術組比較，模型組、PD各劑量組大鼠W/D值均升高（P＜0.05）。與模型組比較，PD高、中劑量組W/D值降低（P＜0.05），而PD低劑量組W/D值差異無統計學意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組W/D值升高（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組W/D值升高（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠肺組織W/D值比較（±s）Tab.3 Comparison of W/D value of lung tissues in each group（±s）

表3 各組大鼠肺組織W/D值比較（±s）Tab.3 Comparison of W/D value of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別n W/D假手術組 10 4.11±0.31模型組 10 6.40±0.52#PD高劑量組 10 4.79±0.38#*PD 中劑量組 10 5.35±0.42#*▲PD 低劑量組 10 6.28±0.49#▲△F值 28.94 P值 ＜0.01

2.4 各組大鼠肺組織MDA水平及SOD活力比較 各組間總體比較，肺組織MDA水平及SOD活力差異有統計學意義（P＜0.01）。 與假手術組比較，模型組、PD各劑量組MDA水平升高，SOD活力降低（P＜0.05）。 與模型組比較，PD高、中劑量組MDA水平降低，SOD活力升高（P＜0.05），而PD低劑量組MDA水平和SOD活力差異無統計學意義 （P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組MDA水平升高，SOD活力降低（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組MDA水平升高，SOD活力降低（P＜0.05）。 見表4。

表4 各組大鼠肺組織MDA水平和SOD活力比較（±s）Tab.4 Comparison of level of MDA and SOD activity of lung tissues in each group（±s）

表4 各組大鼠肺組織MDA水平和SOD活力比較（±s）Tab.4 Comparison of level of MDA and SOD activity of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n MDA（nmol·mg-1） SOD（U·mg-1）假手術組 10 12.44±2.01 53.89±4.58模型組 10 35.61±3.11# 24.28±3.69#PD 高劑量組 10 16.42±2.57#* 45.97±5.87#*PD 中劑量組 10 22.50±2.36#*▲ 38.59±3.86#*▲PD 低劑量組 10 34.87±2.98#▲△ 25.12±3.22#▲△F值 45.74 26.33 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.5 各組大鼠肺組織病理變化比較 HE染色顯示，假手術組大鼠肺組織結構清晰、完整，肺泡腔結構正常，無滲液，無炎性細胞浸潤，肺泡壁光滑。與假手術組比較，模型組大鼠肺組織結構紊亂，肺泡壁明顯增厚，失去正常形態，肺間質水腫充血，可見大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，PD高、中劑量組大鼠肺組織損傷情況得到一定程度改善，肺泡結構基本清晰，水腫和充血程度減輕，有少量炎性細胞浸潤，但PD低劑量組肺組織病理切片仍顯示有大量炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚、充血。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，400×）Fig.1 Comparison of pathological changes of lung tissues in each group（HE staining，400×）

2.6 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達比較 各組間總體比較，肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達差異有統計學意義（P＜0.01）。與假手術組比較，模型組、PD各劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達增高（P＜0.05）。 與模型組比較，PD高、中劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達顯著降低（P＜0.05），而PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達增高（P＜0.05）； 與PD中劑量組比較，PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達增高（P＜0.05）。 見表5。

表5 各組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expression of lung tissues in each group（±s）

表5 各組大鼠肺組織中HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA表達比較（±s）Tab.5 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expression of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n HMGB1 TLR4 NF-κB p65假手術組 10 1.05±0.13 1.02±0.09 0.99±0.10模型組 10 2.65±0.18# 1.95±0.16# 2.78±0.19#PD 高劑量組 10 1.35±0.15#* 1.40±0.13#* 1.38±0.12#*PD 中劑量組 10 1.96±0.16#*▲ 1.72±0.15#*▲ 1.81±0.16#*▲PD 低劑量組 10 2.58±0.20#▲△ 1.98±0.18#▲△ 2.45±0.17#▲△F值 54.11 28.47 36.58 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.7 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達比較 各組間總體比較，肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01）。與假手術組比較，模型組、PD各劑量組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達增高（P＜0.05）。 與模型組比較，PD高、中劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達顯著降低（P＜0.05），而PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與PD高劑量組比較，PD中、低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達增高（P＜0.05）；與PD中劑量組比較，PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達增高（P＜0.05）。見圖2、表6。

表6 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 protein expression of lung tissues in each group（±s）

表6 各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 protein expression of lung tissues in each group（±s）

注：與假手術組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；與PD高劑量組比較，▲P＜0.05；與PD中劑量組比較，△P＜0.05Note:Compared with sham operation group，#P＜0.05;compared with model group，*P＜0.05;compared with PD high-dose group，▲P＜0.05;compared with PD medium-dose group，△P＜0.05

組別 n HMGB1 TLR4 NF-κB p65假手術組 10 0.25±0.02 0.18±0.02 0.23±0.03模型組 10 1.03±0.09# 1.01±0.08# 0.99±0.08#PD 高劑量組 10 0.35±0.04#* 0.30±0.02#* 0.33±0.05#*PD 中劑量組 10 0.54±0.06#*▲ 0.42±0.03#*▲ 0.49±0.06#*▲PD 低劑量組 10 0.98±0.08#▲△ 0.94±0.09#▲△ 0.97±0.08#▲△F值 34.87 49.21 29.44 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖2 Western blot檢測各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65蛋白表達Fig.2 Protein expression of HMGB1，TLR4 and NF-κB p65 in lung tissues in each group detected with Western blot

3 討論

膿毒癥是繼發于感染的致命性急性器官功能障礙，其病理生理反應極為復雜，包括促炎途徑和先天性免疫途徑的激活、適應性免疫途徑的改變等過程，其發生同時也取決于宿主和病原體的特征，以及患者所經歷的醫療事件（如手術和其他感染）和治療方法[10-11]。肺部是膿毒癥病程中最易受到影響的器官，ALI則是膿毒癥誘發的常見炎性疾病，嚴重者可發展為ARDS[12]。臨床研究顯示，中藥對于膿毒癥相關ALI和ARDS具有較好的治療效果，可作為ARDS的臨床輔助治療[13]。PD是中藥虎杖的主要活性成分，Cao等[14]研究發現，PD可通過抑制上皮-間充質轉化過程減輕小鼠放射性肺損傷，從而有效抑制肺炎和肺纖維化的發展。Fu等[15]研究表明，PD可緩解百草枯引起的人胚肺成纖維細胞MRC-5損傷，其機制與抑制炎癥反應、提高抗氧化能力及抑制核苷酸結合寡聚結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體活化有關。雖然已有研究證明，PD對多種肺損傷性疾病具有治療作用，但其對膿毒癥相關ALI的影響尚不清楚。

本研究構建了大鼠膿毒癥ALI模型，造模后大鼠均出現豎毛、少尿、腹瀉、直腸溫度下降現象，皮毛雜亂無光澤，眼角出現血性分泌物，表明造模成功。PD治療后，PD高、中劑量組大鼠豎毛、少尿、腹瀉情況明顯改善，皮毛恢復光澤，眼角分泌物減少，表明一定劑量PD可改善膿毒癥ALI模型大鼠的體征。在膿毒癥相關ALI發病過程中，炎癥反應的迅速發展和氧化應激損傷是導致機體多器官損害的重要原因，多種細胞因子共同參與了這一過程[16-17]。TNF-α是ARDS發生發展中的關鍵因子，能夠刺激其他炎癥因子的分泌和釋放，并逐級擴大炎癥反應，加重肺損傷[18]。在這一過程中，IL-1β和IL-6等炎癥因子大量表達，募集炎性細胞，誘發炎癥級聯反應，可迅速加重病情，甚至導致患者死亡[19]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高；與模型組比較，PD高、中劑量組大鼠血清炎癥因子水平均降低，但低劑量PD干預未達到降低血清炎癥因子水平的效果。模型組大鼠肺組織W/D值顯著升高，與模型組比較，PD高、中劑量組W/D值顯著降低，而PD低劑量組W/D值差異無統計學意義，初步證明一定劑量的PD能夠抑制肺損傷大鼠炎癥反應，減輕膿毒癥誘發的肺損傷。

氧化應激反應是肺損傷的基本病理生理過程，MDA水平高低能夠直接反映機體的氧化應激反應強弱；而SOD則可清除有害氧自由基，抑制氧化應激損傷[20]。本研究中，模型組大鼠肺組織MDA水平顯著高于假手術組，而SOD活力低于假手術組；與模型組比較，PD高、中劑量組MDA水平降低，SOD活力升高，而PD低劑量組MDA水平和SOD活力差異無統計學意義，表明一定劑量PD能夠抑制膿毒癥相關肺損傷的氧化應激反應。進一步采用HE染色觀察各組大鼠肺組織病變，結果顯示，模型組大鼠肺組織結構紊亂，肺泡壁明顯增厚，失去正常形態，肺間質水腫充血，有大量炎性細胞浸潤，而PD高、中劑量組大鼠肺組織損傷得到一定程度緩解，肺泡結構基本清晰，水腫和充血程度減輕，炎性細胞浸潤減少，表明PD能夠顯著減輕膿毒癥誘發的肺組織損傷。

目前雖然膿毒癥相關肺損傷的發病機制尚未完全闡明，但已有研究證明，HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在多種原因所致的肺損傷中發揮了重要調控作用[8]。HMGB1是高度保守的核蛋白，在受到脂多糖、TNF-α或IL-1刺激后，由單核巨噬細胞和其他免疫細胞釋放，也可由受損和壞死的組織細胞被動釋放，進一步促進多種炎癥因子的分泌，參與膿毒癥、敗血癥、肺炎和關節炎等疾病的發展過程[21]。TLR4是HMGB1誘導炎癥的必需受體，HMGB1可激活TLR2和TLR4，進而靶向作用于NF-κB并啟動下游炎癥反應[22]。Wang等[23]研究證明，抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，能夠減輕敗血癥引起的ALI。張建峰等[24]研究發現，右美托咪定能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減輕炎癥反應，緩解大鼠膿毒癥肺損傷。本研究結果提示，與假手術組比較，模型組大鼠肺組織HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達顯著增高；與模型組比較，PD高、 中劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達顯著降低，而PD低劑量組HMGB1、TLR4和NF-κB p65 mRNA和蛋白表達差異無統計學意義，表明PD可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而發揮對膿毒癥相關ALI的治療作用。

綜上所述，PD對大鼠膿毒癥相關ALI具有治療作用，能夠減輕大鼠肺組織病理變化，緩解炎癥和氧化應激損傷，其作用機制與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的活化有關。但本研究僅在體內實驗水平進行了初步探討，更詳細的分子機制仍需結合體外實驗進一步探究。