黑沙蒿多糖對脂多糖刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中免疫指標及相關基因和蛋白表達的影響

邢媛媛 鄭彥楷 郭世偉 王俊麗 金 曉 徐元慶 史彬林

(內蒙古農業大學動物科學學院，呼和浩特 010018)

畜禽的健康極易受到外界各種病原體或非病原體的侵害，促使機體通過一系列代謝行為和神經內分泌的改變來適應新的環境以達到新的動態平衡。在此過程中，畜禽往往會出現精神萎靡、嗜睡、食欲不振，使飼糧中部分用于生長發育的營養物質轉而用于維持動物機體的免疫反應，進而導致畜禽的生長發育緩慢，引起免疫應激[1]。此外，過度的應激反應會產生一些有害代謝產物殘留在肉類及肉制品中，導致肉品質嚴重下降[2]。由此可見，免疫應激不僅影響肉仔雞生長發育，對消費者的健康也有一定的影響。因此，通過綠色無污染的營養調控措施來緩解免疫應激引起的肉仔雞的機體損傷，從而發揮治療和緩解作用是較為理想的選擇。

黑沙蒿廣泛分布于我國內蒙古和陜西等西北地區，是一種較為常見的可防風固沙的菊科蒿屬植物。黑沙蒿在醫藥領域的應用有著悠久的歷史，具有消炎散腫、寬胸利氣和止血的作用，在農業方面還具有殺蟲等功效[3]。研究表明，在飼糧中添加750 mg/kg黑沙蒿多糖(AOP)可顯著改善肉仔雞的生長性能，而這可能與其促進營養物質代謝、改善腸黏膜形態、提高消化酶活性有關[4]。在反芻動物上的研究發現，添加3% AOP可改善反芻動物瘤胃的發酵，提高對營養物質的有效降解，從而改善其生長性能[5]。在嚙齒類動物上也有類似發現，在大鼠飼糧中添加300 mg/kg AOP可提高大鼠平均日增重[6]。有研究者以小鼠腹腔巨噬細胞為載體評價了沙蒿多糖的免疫調節活性，結果發現，沙蒿多糖可激活巨噬細胞，提高巨噬細胞中氧自由基和一氧化氮(NO)的含量，并提高促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素(IL)-6的含量，其具體調控機制為沙蒿多糖被巨噬細胞膜表面的Toll樣受體4(TLR4)識別后，將其信號轉到胞內，隨后激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)和核轉錄因子-κB(NF-κB)p65信號通路，進而發揮其免疫調節活性[7]。

畜禽生長(尤其是早期生長)由于受環境和營養應激等因素的影響，極易損傷腸道屏障，降低免疫機能，造成生長阻滯，甚至導致死亡。研究表明，肉仔雞注射脂多糖(LPS)后激活了TLR4/NF-κB信號通路，并導致IL-1β、IL-6和TNF-α的過度產生[8]，而AOP是否可通過TLR4/NF-κB信號通路緩解由LPS引起的免疫應激，還有待進一步研究。因此，本研究從TLR4/NF-κB信號通路探究AOP對免疫應激狀態下肉仔雞十二指腸中炎癥因子含量的影響，旨在為AOP在肉仔雞飼糧中的科學應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設計

本課題組前期綜合生長性能、血清免疫和抗氧化指標確定AOP在肉仔雞飼糧中的適宜添加量為750 mg/kg[4]，以此作為本研究試驗飼糧中AOP的添加量。通過腹腔注射LPS構建肉仔雞的免疫應激模型。采用2×2雙因子試驗設計，選取192只1日齡愛拔益加(AA)肉仔雞，隨機分為4個處理，每個處理6個重復，每個重復8只雞。試驗期為42 d，分為預試期(第1～14天)、應激Ⅰ期(第15～28天，包括7 d的LPS注射期和7 d的恢復期)和應激Ⅱ期(第29～42天，包括7 d的LPS注射期和7 d的恢復期)。處理1和2飼喂基礎飼糧，處理3和4飼喂試驗飼糧(在基礎飼糧中添加750 mg/kg AOP)。分別在應激Ⅰ期(試驗第15、17、19、21天)和應激Ⅱ期(試驗第29、31、33、35天)給處理1和3的肉仔雞腹腔注射5 mL/kg BW的LPS溶液(LPS溶液濃度為100 μg/mL生理鹽水)，處理2和4的肉仔雞腹腔注射等量的生理鹽水。在應激Ⅰ期(第21天)和應激Ⅱ期(第35天)每個重復隨機選取1只雞，進行屠宰、剖腹，迅速取十二指腸組織樣品，用于測定組織中免疫指標及其相關基因和蛋白的表達。

1.2 飼養管理

試驗期內人工控制舍內光照和溫度，并自然通風。試驗第1周的舍內溫度設定在32～34 ℃，然后每周降低3 ℃，直至21 ℃。試驗第1～3天每天保持23 h光照，第4～21天每天保持10 h光照，第22～42天每天保持23 h光照。舍內相對濕度保持在50%～60%，氨氣濃度為5.1～6.2 mg/m3，風速約為0.5 m/s。根據我國農業行業標準《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)配制玉米-豆粕型粉狀基礎飼糧(表1)，飼養過程中肉仔雞自由采食和飲水。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能

在試驗第1天記錄1日齡肉仔雞的初始體重，于第14、21、28、35和42天對各處理肉仔雞進行稱重、結料，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.3.2 十二指腸中免疫指標

稱取0.5 g十二指腸組織，按1∶9(質量體積比)的比例在冰冷的0.9%生理鹽水中用手持式勻漿器勻漿，隨后離心(4 000×g)15 min，取上清保存于-80 ℃。采用考馬斯亮藍法測定勻漿液上清的蛋白濃度，免疫球蛋白(Ig)G、IgM和IgA及IL-1β、IL-2、IL-4和IL-6含量采用泉州市睿信生物科技有限公司研發的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒進行測定，嚴格按照試劑盒內說明書要求進行。

1.3.3 十二指腸中NF-κB信號通路相關因子的基因表達

表2 引物序列

1.3.4 十二指腸中NF-κB信號通路相關因子的蛋白表達

采用組織或細胞總蛋白提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]按照說明書提取全細胞蛋白。隨后采用BCA蛋白測定試劑盒(北京Beyotime生物技術研究所)，以牛血清白蛋白為標準品測定蛋白濃度。以β-actin作為內參蛋白，采用Western Blot法測定十二指腸中的TLR4、NF-κB激酶抑制因子復合體β(IKKβ)、NF-κB的抑制物α(IκBα)、NF-κB p65、IL-1β、IL-6的蛋白表達水平。主要操作步驟如下：將蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液中(V∶V=4∶1)，煮沸10 min，使蛋白變性，待冷卻后離心收集上清。在各膠孔中加入等量的蛋白質(100 μg)后在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離[依次經濃縮膠(80 V，30 min)和分離膠(120 V，90 min)]，然后轉移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜上(100 V，50 min)。轉膜完成后，用1×TBST洗滌膜，隨后使用封閉液于室溫下避光封閉1 h。封閉完成后再次洗膜。將膜分別在4 ℃條件下過夜進行一抗孵育：兔抗β-actin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗TLR4多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗IKKβ多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗IκBα單克隆抗體(1∶200稀釋)、兔抗NF-κB p65多克隆抗體(1∶100稀釋)、兔抗IL-1β多克隆抗體(1∶10稀釋)和兔抗IL-6多克隆抗體(1∶10稀釋)。次日進行相應的二抗孵育，將山羊抗兔辣根過氧化物酶(HPR)(1∶1 000稀釋)室溫搖床孵育1 h。用ECL超敏發光試劑盒進行顯色，然后利用凝膠成像系統(VILBER FUSION FX7 Spectra，法國)拍照并對條帶強度進行定量分析，計算目的蛋白相對表達量。

目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.4 統計分析

試驗數據采用SAS 9.2分析軟件系統的GLM模型進行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，此外，所有數據進行2×2雙因素方差分析，模型中的因素包括LPS(應激與不應激)和AOP(0和750 mg/kg)以及兩者之間的交互效應。P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞生長性能的影響

AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞生長性能的影響見表3。在應激前(第1～14天)，飼糧中添加AOP對肉仔雞的生長性能沒有顯著影響(P>0.05)。由雙因素方差分析統計結果可知：在應激Ⅰ期(第15～21天)和應激Ⅱ期(第29～35天)，以AOP為主效應分析，飼糧中添加AOP顯著增加了肉仔雞的ADG(P<0.05)，并顯著降低了F/G(應激Ⅰ期，P<0.05)；以LPS為主效應分析，注射LPS顯著降低了肉仔雞ADG(應激Ⅰ期)和ADFI(P<0.05)；AOP和LPS對肉仔雞的生長性能無顯著的互作效應(P>0.05)。多重比較結果顯示：在應激Ⅰ期和應激Ⅱ期，非應激狀態下，AOP有增加肉仔雞ADG和ADFI的趨勢，而應激狀態下，AOP顯著緩解了由LPS導致的肉仔雞ADG的下降(P<0.05)。

表3 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞生長性能的影響

由雙因素方差分析統計結果可知：在恢復Ⅰ期(第22～28天)和恢復Ⅱ期(第36～42天)，以AOP為主效應分析，飼糧中添加AOP顯著增加了肉仔雞的ADG和ADFI(P<0.05)；LPS作為主效應單獨作用及LPS與AOP的互作效應對肉仔雞生長性能的影響均不顯著(P>0.05)。多重比較結果顯示：恢復Ⅰ期和恢復Ⅱ期，非應激狀態下，AOP顯著增加肉仔雞ADG和ADFI(恢復Ⅰ期)(P<0.05)，應激狀態下，AOP有增加肉仔雞ADG的趨勢。

2.2 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中免疫指標的影響

AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中免疫指標的影響見表4。由雙因素方差分析統計結果可知：以AOP作為主效應，飼糧中添加AOP顯著降低了肉仔雞十二指腸中IL-1β(第35天)、IL-6(第21和35天)和IL-4(第21天)的含量(P<0.05)，但卻顯著增加了肉仔雞十二指腸中sIgA(第21天)和IgM(第35天)的含量(P<0.05)；以LPS為主效應，注射LPS顯著增加了肉仔雞十二指腸中IL-1β(第21和35天)、IL-6(第21和35天)和IL-4(第21天)的含量(P<0.05)，卻顯著降低了十二指腸中sIgA(第21天)的含量(P<0.05)；LPS與AOP的互作效應對肉仔雞十二指腸中IL-1β(第35天)、IL-6(第21和35天)、IL-2(第21天)、IL-4(第21和35天)、sIgA(第21天)和IgM(第21和35天)的含量有顯著影響(P<0.05)。多重比較結果顯示：非應激狀態下，飼糧中添加AOP有提高肉仔雞十二指腸中IL-1β(第35天)和IL-6(第35天)的含量的趨勢，同時顯著升高了十二指腸中sIgA(第21天)和IgM(第35天)的含量，而在應激狀態下，飼糧中添加AOP顯著緩解了由LPS導致的肉仔雞十二指腸中IL-1β(第21和35天)、IL-6(第21和35天)和IL-4(第21天)的過度產生，且顯著緩解了IgM(第21天)含量的過度下降(P<0.05)。

表4 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中免疫指標的影響

續表4項目Items-AOP-LPS+LPS+AOP-LPS+LPSP值P-valueSEMP值 P-valueAOPLPSAOP×LPS白細胞介素-4 IL-4/(pg/mg prot)2.51b3.77a2.27b2.62b<0.010.18<0.01<0.010.04分泌型免疫球蛋白A sIgA/(ng/mg prot)2.67b2.62b4.45a3.13b<0.010.19<0.01<0.010.01免疫球蛋白G IgG/(μg/mg prot)48.0151.5751.7561.170.113.500.100.090.43免疫球蛋白M IgM/(μg/mg prot)11.91ab9.99b11.41b14.16a0.020.810.050.720.01第35天 Day 35白細胞介素-1β IL-1β/(pg/mg prot)4.01c16.50a6.64bc8.90b<0.010.740.04<0.01<0.01白細胞介素-6 IL-6/(pg/mg prot)0.45c2.69a0.71bc1.19b<0.010.170.03<0.01<0.01白細胞介素-2 IL-2/(pg/mg prot)3.364.875.265.060.100.540.170.210.18白細胞介素-4 IL-4/(pg/mg prot)2.053.662.852.610.060.370.940.080.03分泌型免疫球蛋白A sIgA/(ng/mg prot)3.354.062.963.460.550.450.390.260.85免疫球蛋白G IgG/(μg/mg prot)45.3558.0359.0753.740.335.460.380.500.14免疫球蛋白M IgM/(μg/mg prot)11.37b14.73ab17.62a14.11ab0.041.400.040.850.04

2.3 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子基因表達的影響

AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子基因表達的影響見表5。由雙因素方差分析統計結果可知：以AOP為主效應，飼糧中添加AOP顯著降低了肉仔雞十二指腸中IL-1β(第21天)的基因表達量(P<0.05)；以LPS為主效應，注射LPS顯著促進了肉仔雞十二指腸中TLR4(第35天)、NF-κBp65(第21和35天)和IL-1β(第21和35天)的基因表達量(P<0.05)；LPS與AOP的互作效應顯著影響肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第35天)及IL-1β(第21天)的基因表達量(P<0.05)。多重比較結果顯示：非應激狀態下，飼糧中添加AOP有提高肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第21天)和IL-1β(第35天)的基因表達量的趨勢，而在應激狀態下，飼糧中添加AOP顯著緩解了由LPS導致的肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第35天)和IL-1β(第21天)基因的過表達(P<0.05)。

表5 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子基因表達的影響

2.4 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子蛋白表達的影響

AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子蛋白表達的影響見圖1和表6。由雙因素方差分析統計結果可知：以AOP為主效應，飼糧中添加AOP顯著降低了肉仔雞十二指腸中IKKβ(第21和35天)、NF-κB p65(第35天)、IL-1β(第21和35天)和IL-6(第35天)的蛋白表達量，顯著升高了十二指腸中IκBα(第21和35天)的蛋白表達量(P<0.05)；以LPS為主效應，注射LPS顯著上調了肉仔雞十二指腸中TLR4(第35天)、IKKβ(第21和35天)、NF-κB p65(第21和35天)、IL-1β(第21和35天)、IL-6(第21和35天)的蛋白表達量(P<0.05)，顯著降低了十二指腸中IκBα(第21和35天)的蛋白表達量(P<0.05)；LPS與AOP的互作效應顯著影響除TLR4(第21天)和IκBα(第35天)外的肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子的蛋白表達量(P<0.05)。多重比較結果顯示：非應激狀態下，飼糧中添加AOP顯著促進了NF-κB信號通路相關因子[TLR4(第35天)、IKKβ(第21和35天)、NF-κB p65(第21天)、IL-1β(第21和35天)和IL-6(第35天)]的蛋白表達(P<0.05)，而在應激狀態下，飼糧中添加AOP顯著緩解了由LPS導致的肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關蛋白(NF-κB p65、IL-1β和IL-6，第21和35天)的過表達(P<0.05)，且顯著促進了IκBα(第21和35天)的蛋白表達(P<0.05)。

表6 AOP對LPS刺激的免疫應激肉仔雞十二指腸中NF-κB信號通路相關因子蛋白表達的影響

-：不添加或不注射；+：添加或注射；AOP：黑沙蒿多糖；LPS：脂多糖。-: no addition or no injection; +: addition or injection; AOP: Artemisia ordosica polysaccharide; LPS: lipopolysaccharide.

3 討 論

經腹腔或者肌肉注射LPS能夠建立肉仔雞免疫應激模型，處于免疫應激狀態下的肉仔雞生長發育緩慢[1]，而相關研究表明添加植物多糖可以提高動物的生長性能[9-10]。然而針對AOP對LPS刺激的免疫應激肉雞生長性能影響的研究卻鮮見報道。在本研究中，AOP對LPS刺激前肉仔雞的生長性能并沒有顯著影響。在應激期，非應激狀態下，飼糧中添加AOP促進了肉仔雞的生長。此外，飼糧中添加AOP可緩解由LPS導致的肉仔雞生長的阻滯。在恢復期，飼糧中添加AOP更有助于肉仔雞從免疫應激中恢復。研究表明，植物提取物可通過緩解由LPS導致的小腸消化酶活性降低、腸道形態損傷和腸道菌群改變等途徑來提高營養物質消化率[11]，進而促進肉仔雞的生長發育，而這也可能是AOP緩解LPS導致的肉仔雞生長阻滯的主要原因，其具體機制還有待進一步研究。

研究表明，LPS是最常用的研究免疫應激的細菌毒素之一，它會引起全身炎癥和敗血癥[12]。LPS又稱內毒素，是革蘭氏陰性桿菌細胞壁的主要組分，當其進入宿主后，會刺激單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等免疫細胞，通過細胞膜及細胞內的一系列級聯反應，最終活化NF-κB信號通路。而NF-κB信號通路的主要功能之一是調控免疫炎癥反應相關基因的表達，進而調節促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α等)的過度產生與釋放，這些生物活性分子通過“神經-內分泌-免疫”網絡，誘導動物在短時間內產生細菌感染癥狀，引發動物免疫應激。本研究表明，飼糧中添加AOP可緩解由LPS導致的肉仔雞十二指腸中IL-1β、IL-6和IL-4的過度產生，且可緩解IgM的過度下降，這說明AOP可緩解LPS對肉仔雞十二指腸的免疫應激。

如前所述，LPS會導致TLR4/NF-κB信號通路的過度激活，而植物多糖可通過TLR4/NF-κB信號通路調控免疫細胞因子的表達[13]，進而緩解由LPS導致的免疫應激。其中，腸上皮細胞TLR4是植物多糖的特異性受體，可通過調節TLR4的轉錄水平激活NF-κB的表達，進而改善LPS引起的機體損傷[14]。此外，NF-κB作為動物免疫應答中細胞因子的調控通路，既能夠直接調節與免疫相關細胞因子的表達，還能夠抵抗細胞凋亡因子的表達，維持細胞正常的生理功能，此外，它對維持動物腸道上皮細胞屏障的完整性也有一定的作用[15]。研究發現，黃芪多糖可通過抑制TLR4的基因轉錄和NF-κB的抑制物(IκB)的降解，來減弱NF-κB的激活，進而下調促炎因子表達，抑制由LPS誘導的免疫應激反應[16]。據報道，人參多糖和黑莓多糖也可降低由LPS刺激導致巨噬細胞中TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表達量的提高，從而降低促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌及表達，減少機體免疫應激反應[17-18]。本研究也得出相似的結論，飼糧中添加AOP緩解了由LPS導致的肉仔雞十二指腸中NF-κBp65(第21天)和IL-1β(第35天)基因的過表達，以及NF-κB信號通路相關蛋白(NF-κB p65、IL-1β和IL-6)的過表達，且促進了IκBα的蛋白表達。這提示AOP可通過抑制NF-κB信號通路的過度激活來抑制LPS導致的促炎因子的過度釋放，從而緩解肉仔雞的免疫應激。

此外，本研究表明，非應激狀態下，飼糧中添加AOP有提高肉仔雞十二指腸中IL-1β、IL-6和IL-4含量的趨勢，同時顯著升高了十二指腸中IgA(第21天)和IgM(第35天)的含量，這可能與AOP有提高NF-κBp65(第21天)和IL-1β(第35天)基因表達的趨勢，且增加了NF-κB信號通路相關基因及其下游靶基因的蛋白表達有關，這也揭示了AOP對NF-κB信號通路的調控是雙向的，即AOP能激活正常靜息狀態的免疫系統，可輕微刺激肉仔雞十二指腸中促炎因子的表達。但當機體免疫系統處在過度激活狀態時，AOP又能下調LPS誘導產生的大量促炎因子的表達，抑制NF-κB信號通路的過度激活，這和前人對云芝糖肽的免疫調節作用的研究結果[19]相一致。據此推斷，AOP對不同狀態下(應激與不應激)動物機體NF-κB信號通路的調控之所以呈現出看似矛盾的結果，一方面與其雙向調控作用有關，另一方面與其和其他信號通路的相互作用有關，故此AOP對不同信號通路究竟是發揮協同作用、抑制作用還是拮抗作用仍需大量的研究。

4 結 論

綜上可知，飼糧中添加750 mg/kg AOP可緩解由LPS導致的肉仔雞生長性能的下降，并通過抑制NF-κB信號通路的過度激活來抑制LPS導致的十二指腸中促炎因子的過度釋放。