2,4-表油菜素內酯對煙苗幼莖生長及相關基因表達的影響

張娟 吳曉穎 許娜 杜沙沙 張彥 馬興華

摘 要：為研究油菜素內酯（Brassinolide， BR）對煙草主莖生長的影響，利用外源2， 4-表油菜素內酯（2， 4-Epibrassinolide， EBR），設置0.5×10-7 mol/L（T1）、0.5×10-5mol/L（T2）兩個濃度，以蒸餾水（CK）為對照對煙草幼苗進行噴施。分析了不同處理的煙草幼苗株高，節距及解剖結構特征，檢測了莖中與細胞分裂和細胞大小調控相關基因以及與油菜素內酯（BR）、生長素（IAA）和赤霉素（GA）合成相關基因的表達量。結果表明，噴施EBR對煙草幼苗節距和株高有顯著促進作用，并隨處理濃度升高，促進作用增強。觀察石蠟切片發現EBR處理后莖皮層薄壁細胞數目增多，單細胞面積減小。EBR處理后，細胞周期調控基因NtCYCD3表達上調，細胞大小調控基因NtARF6、NtARF16表達下調;BR信號受體基因NtBRI1，NtBIN2表達上調，BR轉錄因子NtBES1T表達下調;BR、IAA和GA的關鍵生物合成基因NtDWF4、NtYUCCA8、NtGA3ox-2表達量均上調。說明噴施EBR可促進內源BR、IAA和GA的合成基因表達，通過促進節間細胞分裂、抑制細胞大小促進煙草幼苗莖的生長。

關鍵詞：2， 4-表油菜素內酯;煙草;莖伸長生長;解剖結構;基因表達量

Abstract： To study the effect of brassinolide （BR） on tobacco stem growth and elongation， the tobacco seedlings were treated with 2，4-epibrassinolide （EBR） of two different concentrations 0.5×10-7 mol/L （T1）， 0.5×10-5 mol/L （T2） and distilled water was used as control （CK）. Plant height， internode distance， and stem anatomical structure were analyzed. Genes related to cell division and cell size regulation， and genes related to biosynthesis of BR， auxin （IAA）， and gibberellin （GA） were also analyzed. The results showed that the application of EBR increased the seedling pitch and plant height， the promotion effect on stem growth was enhanced with increment of EBR concentrations. Stem anatomical study revealed an increase in the number of parenchyma cells and a decrease in its area after EBR treatment. EBR upregulated cell cycle-related gene NtCYCD3 while downregulated NtARF6 and NtARF16 genes that are related to cell size. Similarly， BR signaling receptor genes NtBRI1 and NtBIN2 were upregulated while the BR transcription factor NtBES1T was downregulated in response to EBR application. The expression of key biosynthesis genes NtDWF4， NtYUCCA8， and NtGA3ox-2 of BR， IAA， and GA， respectively， were all upregulated. The results showed that the application of EBR promoted the expression of endogenous BR， IAA and GA biosynthesis genes， and helped in the growth and elongation of tobacco seedling stem by promoting the division of internode cells and inhibiting cell expansion.

Keywords： 2， 4-epibrassinolide; Nicotiana tabacum; stem elongation; anatomical structure; gene expression;

莖是植物的三大營養器官之一，具有支持、運輸、儲存、繁殖和光合的功能，在植物的生長發育過程中起著不可替代的作用[1]。株高是指植株主莖基部到頂部之間的距離，由植株的莖節數目和節間長度決定，是農作物重要的生物學性狀之一，與作物經濟產量密切相關。適當的株高能抗倒伏，還有利于CO2的分布，提高光能利用率[2]。

植物株高的增長包括主莖節數的增多以及各節間的伸長[3]。細胞的分裂和伸長是植物莖伸長生長的主要原因，這一過程受多種內外因素的調節和控制。油菜素內酯（BR）是一種甾醇類植物激素，具有促進生長、增加植物抗逆性、延緩衰老、促進細胞再分化等功能，但最突出的生理作用就是促進植物的生長[4]。BR對植物生長的促進是通過促進細胞分裂和伸長的作用實現的，并且這一促進作用具有濃度效應，多表現為低濃度促進高濃度抑制[5-6]。EBR是廣泛使用的一種人工合成油菜素內酯，具有提高煙草抗旱性[7]，促進十字花科植物幼苗和豌豆上胚軸細胞伸長[8]，誘導水稻節間伸長[9]的功能。

株高是與烤煙產值關系最密切的因素之一，煙草株高通過影響煙株有效葉數、葉長、葉寬而間接影響煙葉產量和品質[10-11]。而目前關于施用植物生長調節劑對煙草莖伸長生長的研究報道尚少;施用BR如何影響煙草主莖伸長，是否會影響GA、IAA含量及其合成基因的表達等尚未見報道。因此本研究通過噴施不同濃度EBR，從生物學性狀，莖細胞解剖學特征，控制細胞分裂和大小的關鍵基因、BR信號通路基因和內源激素合成相關基因表達量等方面分析其對煙草莖伸長生長的影響，進一步闡述外源植物生長調節劑在調控煙草莖生長中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為普通煙草K326，由國家農作物種質資源平臺煙草種質資源子平臺提供，2，4-表油菜素內酯購于索萊寶生物有限公司。

1.2 試驗設計

在中國農業科學院煙草研究所即墨試驗基地進行。共設置0.5×10-7 mol/L（T1）、0.5×10-5 mol/L（T2）兩個濃度，以蒸餾水（CK）為對照。育苗基質（泥炭和蛭石比例為1∶1）經120 ℃滅菌20 min后裝盆，種子直接播種于規格為5 cm×5 cm×7 cm的黑色塑料花盆中并于種子萌發一周后間苗，每盆保留一棵幼苗，每個處理30盆。當煙苗生長至4葉1心時，選出長勢均勻一致的煙苗，每天于15：00噴施1次，葉片正面均勻噴施，噴至葉片上形成均勻的液滴為止，連續噴施5 d。

1.3 測定方法

1.3.1 煙草主莖生物學性狀調查 噴施EBR處理5 d后，每個處理選長勢均勻一致的植株10株，去除葉片和根系后留主莖拍照，用Image J軟件測量株高（根莖結合處到心葉葉柄著生處的距離）和節距（自下而上第5節節距）。

1.3.2 莖細胞解剖學特征觀察 取第5片真葉葉柄著生處1 cm長的莖組織，用FAA固定液（含5%醋酸，70%乙醇和5%甲醛，體積分數）固定，然后經乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切割成5 μm薄片，甲苯胺藍染色，明膠封片后于光學顯微鏡（Leica DMC 2900，上海徠卡儀器有限公司）下觀察皮層薄壁細胞形態和細胞數目，用Image J軟件計算細胞面積。

1.3.3 RNA提取和qRT-PCR 參考已發表的擬南芥的基因序列，在NCBI網站（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）中搜索獲得BR、IAA、GA合成與轉導相關的基因以及與細胞大小、細胞分裂相關基因的序列（表1）。

2 結 果

2.1 噴施EBR對煙草幼苗生物學性狀的影響

不同濃度EBR處理下煙苗主莖見圖1，EBR葉面噴施5 d后觀察莖的生物學性狀發現（圖2），EBR濃度越高，煙草幼苗株高越高，T1、T2較CK分別增加17.8%和23.13%。同時測量了自下而上第五節節距，發現節距也隨著EBR濃度升高而增大，T1、T2較CK分別增加7.35%和32.35%。不同濃度EBR處理下葉片數沒有顯著差異。結果表明在本試驗濃度范圍內，EBR具有促進主莖伸長的作用。

2.2 噴施EBR對煙草皮層薄壁細胞的影響

EBR處理5 d后觀察第5片真葉葉柄著生處莖的縱切面（圖3），用Image J軟件測量皮層薄壁細胞面積發現，EBR處理后皮層薄壁細胞面積較CK顯著減小，而T1和T2處理間細胞面積無顯著性差異。其中T1處理下皮層薄壁細胞面積為36.46 μm2，比CK（51.19 μm2）減小28.39%，T2處理下皮層薄壁細胞面積為35.16 μm2，比CK減小31.53%。雖然細胞面積減小，但是T1、T2處理下單位面積內細胞數目顯著增加，其中T1處理下外皮層單位面積內細胞數目為1 325.67個/mm2，比CK（734.37 個/mm2）增加80.52%;T2處理下外皮層單位面積內細胞數目為1 267.27個/mm2，比CK增加73.02%。說明EBR處理使細胞數目增多，細胞面積減小。

2.3 噴施EBR對基因表達量的影響

不同濃度EBR處理24 h后，BR、IAA、GA相關基因和細胞分裂、細胞大小調控基因表達量如圖4-6所示。由圖4可見，T2處理細胞周期蛋白基因NtCYCD3表達量較CK增加105.2%。T1處理細胞大小調控基因NtARF6表達量較CK下降75.9%，T2處理較CK下降60.9%。T1處理細胞大小調控基因NtARF16表達量較CK下降39.4%，T2處理較CK下降23.9%。可見EBR處理促進了細胞分裂基因的表達，抑制了細胞大小調控基因的表達。

由圖5可見，T2處理BR受體基因NtBR11表達量較CK增加234.1%，NtBIN2表達量較CK增加71.22%。T1處理BR信號轉錄因子NtBES1T的表達量較CK下降71.5%，T2處理較CK下降95.9%。由圖6可見，T2處理BR合成基因NtDWF4表達量較CK提高105.5%，IAA生物合成基因NtYUCCA8表達量較CK增加36.3%。T1處理GA生物合成基因NtGA3ox-2表達量較CK增加116.3%，T2處理增加162.4%。EBR處理后BR、IAA、GA合成基因表達量均增加，對應受體基因表達量增加，轉錄因子表達量下降。說明EBR處理促進細胞分裂和BR、IAA、GA的合成。

3 討 論

BR通過激活細胞分裂、促進細胞伸長而促進節間伸長[4-5]。在本試驗中，不同濃度EBR處理后煙草幼苗主莖均顯著伸長，葉片數無顯著差異，節距顯著增大，細胞數目增多（圖1），因此EBR可能是通過促進節距增加而促進主莖伸長。細胞周期蛋白基因CYCD3具有通過調節細胞增殖影響植株葉形和細胞數目的作用[18]，研究證明EBR促進AtCYCD3的轉錄促進細胞分裂[19]。本研究檢測了莖中NtCYCD3的表達量，結果顯示在T2處理下其表達量顯著增加，說明NtCYCD3參與了EBR調控主莖伸長的過程。BR可使細胞壁松弛，促使細胞攝入水分而產生機械膨大[8]。本試驗中細胞并未膨大而是出現了面積減小的現象，這一現象出現的原因有待進一步研究。NtARF6和NtARF16能調控細胞分裂和細胞大小，NtARF16基因過表達擬南芥葉片的細胞面積顯著增大[14]。本研究發現EBR處理后NtARF6和NtARF16在莖中的表達量下降，細胞面積減小。以上結果從轉錄水平解釋了BR通過促進細胞分裂，增加細胞數量進而促進莖伸長生長。

在BR信號轉導途徑中，細胞膜外受體激酶BRI1與BR結合后，使BKI1磷酸化，同時BIN2被磷酸酶BRI1-SUPPRESSO1（BSU1）脫磷酸化并被降解，抑制了BES1/BZR1的表達[20-21]。之后，BR通過調節編碼XET基因的表達來促進細胞壁的松弛，減小壁壓，降低水勢，使水分和養分進入細胞，促使細胞擴大[8]。在本試驗中，T2處理中BR促進了NtBRI1和NtBIN2在莖上部的表達，在T1和T2處理中BR抑制了NtBES1T的表達。而T1濃度處理下BR的促進效應并不顯著，可能是因為煙草主莖對低濃度BR并不敏感。這些結論說明EBR處理可以提高BR信號轉導途徑中基因的表達，進而促進BR信號轉導激活BR反應。

BRs合成酶DWF4是BR合成關鍵酶[22]，DWF4的轉錄表達量與有活性的BR含量呈正相關[23]。擬南芥中，YUCCA能催化吲哚-3-丙酮酸（IPyA）氧化脫羧過程中的不可逆限速步驟，形成IAA[24]。研究表明，BR調節GA生物合成以調節細胞伸長[25]。通過分析BR突變體，發現GA含量以及GA代謝基因（包括GA20ox-2，GA3ox-2和GA2ox-3）的表達與BR含量相關[26]。本研究通過對BR、IAA和GA的合成基因進行檢測，發現EBR處理除了誘導BR合成關鍵基因NtDWF4表達上調外，還促進了植物IAA生物合成基因NtYUCCA8和GA生物合成基因NtGA3ox-2的表達（圖5），而且IAA的合成和應答反應對高濃度的EBR響應敏感。相較于IAA，GA對BR的反應似乎更為敏感，NtGA3ox-2的表達量在T1濃度處理下就已顯著升高，在T2濃度處理下表達量變化較T1更加顯著。這也充分說明BR可影響內源激素的合成。

4 結 論

試驗結果表明，噴施0.5×10-7 和0.5×10-5 mol/L EBR使煙草幼苗節距和株高增加，并且隨濃度升高增加效應增大。EBR通過促進細胞分裂進而促進莖的伸長。EBR處理后莖皮層薄壁細胞數目增多，細胞分裂基因表達量增加;細胞面積減小，細胞大小調控基因表達量下降。同時，噴施EBR會促進內源BR信號轉導相關基因和BR、IAA、GA合成基因的表達。

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