一種簡(jiǎn)單科學(xué)高效的桑白皮總黃酮含量測(cè)定方法

劉宇航，周伊寧，劉衛(wèi)東，于海泉

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010100；2.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份公司，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥新藥研發(fā)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010)

桑白皮為桑科植物桑MorusalbaL.干燥根皮，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性味甘寒，歸肺脾經(jīng)，具有瀉肺平喘，行水消腫的功效[1]，主產(chǎn)于安徽、河南、浙江、江蘇、湖南等地[2]。

20世紀(jì)70年代開始，野村太郎等人發(fā)現(xiàn)了桑白皮中的桑酮G等成分[3];桑白皮藥材含量研究概述如下：徐世義等[4]以桑酮G為對(duì)照品的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。陳菁菁等[5]、董德剛等[6]、徐應(yīng)淑等[7]、李洪娟等[8]、羅國(guó)慶等[9]、周鋒[10]均以蘆丁為對(duì)照品的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法方法；宗玉英等[11]以桑辛素為對(duì)照品，形成桑白皮藥材高效液相色譜法含量測(cè)定方法；張國(guó)剛等[12]以桑酮G為對(duì)照品，確定了高效液相色譜法含量測(cè)定方法；王信等[13]以桑根酮C為對(duì)照品，用鎂粉-鹽酸法比色法測(cè)定桑白皮異戊烯基總黃酮得方法、采用HPLC法測(cè)定同時(shí)測(cè)定桑根酮C、D和桑辛素含量方法;謝體波等[14]，以自制摩魯新L為對(duì)照品，以3% A1C13溶液為顯色劑，形成桑白皮總黃酮含量方法；張蕾等[15]以蘆丁為對(duì)照品，以A1C13溶液為顯色劑，測(cè)定桑白皮總黃酮。

目前桑白皮總黃酮含量比色方法雖多，其中多數(shù)以蘆丁為對(duì)照品。但據(jù)報(bào)道，桑白皮中不含有蘆丁成分，所以該法專屬性不強(qiáng)。高效液相法無法測(cè)定總黃酮；其他總黃酮方法，操作繁瑣；現(xiàn)有測(cè)定桑白皮中抗骨質(zhì)疏松高效成分異戊烯基總黃酮的含量的方法中只有王信等的以桑根酮C為對(duì)照品的鎂粉-鹽酸法，雖然專屬高，但反應(yīng)操作繁瑣，反應(yīng)劇烈、不易掌握。鑒于本課題以純化桑白皮異戊烯基總黃酮為目的。綜合考慮，我們?cè)囼?yàn)了醋酸鎂比色法，發(fā)現(xiàn)采用本實(shí)驗(yàn)的方法，以桑根酮C為對(duì)照品，是一種測(cè)定桑白皮中總黃酮的簡(jiǎn)便有效的方法。

1 材料與儀器

桑根酮C對(duì)照品(BaoJi Herbet Bio-Tech Co，Lot：HS052273198純度≥98%)；桑白皮藥材(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司)；桑白皮藥材提取物(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司)；醋酸鎂(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)和甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)為分析純。

紫外可見分光光度儀(UV-2450，島津公司，出廠編號(hào)：A10834201051)；萬分之一天平(瑞士梅特勒天平公司，型號(hào)XPR10)；超聲波恒溫清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、FLEXA HP050二元梯度高壓快速純化制備色譜制備系統(tǒng)(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱定桑根酮C對(duì)照品適量，用甲醇溶解配成176.92μg/mL溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

取桑白皮提取物0.10g，精密稱定，置25mL量瓶中。加甲醇適量，超聲(20℃、90%)20min，靜置至室溫，加甲醇定容到刻度，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的研究

精密量取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液3mL，置10mL容量瓶中，加1%醋酸鎂甲醇溶液定容到刻度，搖勻。精密量取2.2項(xiàng)下1mL供試品溶液，置50mL容量瓶中后加1%醋酸鎂甲醇溶液定容到刻度，搖勻。用相應(yīng)試劑做空白溶液，在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 桑白皮對(duì)照品和供試品紫外掃描圖

由于最大吸收波長(zhǎng)處的吸收峰，峰形非常尖銳，試驗(yàn)效果容易波動(dòng)，引起較大的誤差。故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為接近最大吸收波長(zhǎng)，位于兩吸收峰之間的一個(gè)緩坡處的吸收峰處進(jìn)行研究。故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為293nm。

2.4 線性關(guān)系研究

精密量取2.1項(xiàng)下桑根酮C對(duì)照品溶液4、5、10、15、20mL，置100mL容量瓶中后加1%醋酸鎂甲醇溶液定容，搖勻。用相應(yīng)試劑為空白溶液，在293nm波長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸光度。以紫外吸光度為縱坐標(biāo)，桑根酮C濃度(ug/mL)為橫坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得方程y=0.03872x-0.00676，r2=0.99975。說明在4.1180～24.7080ug/mL內(nèi)線性關(guān)系滿足要求。如圖2。

圖2 桑根酮C標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度研究

精密吸取2.1項(xiàng)下桑根酮C對(duì)照品溶液1mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。用相應(yīng)試劑為空白溶液，在293nm波長(zhǎng)處測(cè)定紫外吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，記錄紫外吸光度值，計(jì)算RSD。結(jié)果說明對(duì)照品溶液紫外吸光度的RSD為0.0534%(n=6)，說明儀器精密度非常好。

2.6 重復(fù)性研究

取同一批次的桑白皮提取物6份，按2.2項(xiàng)下確定方法制備供試品溶液，精密量取1mL供試品溶液，置100mL容量瓶中后加1%醋酸鎂甲醇溶液定容至刻度，搖勻。用相應(yīng)試劑做空白對(duì)照，在293nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算供試品中總黃酮類化合物的含量及RSD。結(jié)果表明總黃酮類化合物含量為0.3544mg/mL，RSD為1.81%，說明本方法重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性研究

取一批次的桑白皮提取物，按2.2項(xiàng)下確定方法制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1mL，置100mL容量瓶中后加1%醋酸鎂甲醇溶液定容至刻度，搖勻。用相應(yīng)試劑做空白對(duì)照溶液，分別于0、30、60、90、120、150、180min在293nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD。結(jié)果表明供試品吸光度的RSD為1.83%，說明供試品在180min內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.8 加樣回收率研究

2.8.1對(duì)照品溶液的配置

取桑根酮C對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配置成82.36ug/mL。

2.8.2加樣回收率研究

精密量取2.6項(xiàng)下各供試品溶液0.6mL和10mL對(duì)照品溶液，置100mL容量瓶中后加1%醋酸鎂甲醇溶液定容到刻度，搖勻。用相應(yīng)試劑為空白對(duì)照溶液，在293nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果表明本方法平均回收率為95.95%，RSD為2.50%，說明本方法加樣回收率符合規(guī)定。研究結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率考察結(jié)果表

2.9 桑白皮的提取及純化后的樣品含量測(cè)定

取3種方法提取分離的桑白皮提取物樣品，按2.2項(xiàng)下確定的方法配制供試品溶液。精密量取各批次配制的溶液進(jìn)行吸光度測(cè)定，并計(jì)算樣品的含量。

表2 桑白皮提取及純化后樣品含量測(cè)定

3 討論

桑白皮中的豐富黃酮類化合物，具有抗骨質(zhì)疏松作用。測(cè)定結(jié)果說明通過大孔樹脂-AB-8純化效果好[16]。

常用的中藥材總黃酮的紫外含量研究方法有鹽酸-鎂粉比色法[16]；Al(NO3)3比色法[17]；A1C13比色法[18]；NaOH比色法[19]；醋酸鎂甲醇比色法[20]。本實(shí)驗(yàn)通過醋酸鎂甲醇比色與目前已有的桑白皮中比色法方法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法、鹽酸-鎂粉比色法和A1C13比色法[21，22])對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)采用醋酸鎂甲醇比色法，具有操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)溫和，不需要加熱等優(yōu)勢(shì)，可避免實(shí)驗(yàn)復(fù)雜操作帶來的誤差；顯著提高桑白皮總黃酮含量測(cè)定的效率和準(zhǔn)確性。

根據(jù)桑白皮藥材、醇提物、醇提物上AB-8大孔樹脂后提取物用水、不同濃度乙醇洗脫，含量測(cè)定結(jié)果分析，說明桑白皮異戊烯基總黃酮，藥材含量很低，用60%乙醇提取是合適的，上大孔樹脂后，水幾乎洗不下來，大部分在50%～60%被洗脫下來，80%乙醇洗脫很少，但得到的提取物的卻具有總黃酮純度高的特點(diǎn)。