榮筋拈痛方含藥血清對骨關節炎大鼠SDF-1／CXCR4信號通路的影響

陳 俊，鄭若曦，張 婷，戴雨婷，葉錦霞，3，吳廣文，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122；3.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州350122）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是中老年人群中常見的一種關節疾患，發病部位可位于膝關節等全身多處關節，常表現為關節疼痛、腫脹和活動受限，嚴重者可致畸致殘，對患者日常的工作生活帶來極大困擾［1］。相關研究發現，OA與炎癥和內質網應激有關［2-3］。因此，調控炎癥環境和應激是治療OA的有效途徑，而基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived faceor-1，SDF-1）與趨化因子CXC基序受體4（chemokine C-X-C motif receptor 4，CXCR4）信號通路在炎癥反應方面具有重要作用［4］。榮筋拈痛方源于國醫大師陳可冀院士《清宮配方集成》［5］中治療骨痹的高頻、核心用藥組方，包括牛膝、當歸、獨活等六味藥，具有補肝腎、壯筋骨、祛風濕、止痹痛的功效［6］。前期研究發現，榮筋拈痛方可有效改善膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）患者的臨床癥狀［7］，延 緩 軟 骨 退 變［8-9］，但 是 否 通 過 調 節SDF-1／CXCR4信號通路發揮作用，尚不明確。本研究以SD大鼠OA滑膜細胞和退變軟骨細胞為研究對象，觀察榮筋拈痛方含藥血清對SDF-1／CXCR4信號通路相關調節因子的影響，探討榮筋拈痛方治療OA的作用機制，為其臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物2月齡SPF級SD大鼠45只和4周齡SPF級SD大鼠6只均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2019-0007。

1.2 實驗藥物 榮筋拈痛方包括牛膝、當歸、獨活等六味藥，購于閩侯縣上街致誠醫藥商店。制備方法：按固液比1∶10加入蒸餾水進行回流提取，提取3次，每次1.5 h，離心去除藥渣后合并濾液，旋轉蒸發濃縮至一定生藥量后置于4℃存儲備用。

1.3 實驗試劑SDF-1 ELISA檢測試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；SDF-1、CXCR4、基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）-3、MMP-9、MMP-13一抗（美國Abcam公司）；二抗（美國Millipore公司）；SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13引物（福州尚亞生物技術有限公司）。

1.4 實驗儀器 酶標儀（Thermo Fisher Scientific公司）；ABI實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；蛋白核酸分析儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 健康2月齡SPF級SD大鼠36只，雌雄各半。按1∶2的比例隨機分為空白血清組12只與含藥血清組24只，動物給藥劑量根據“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”換算［10］，含藥血清組大鼠按4.5 g／（kg·d）予榮筋拈痛方藥液灌胃，分上午、下午2次灌胃；空白血清組于同等條件下灌服等體積的生理鹽水。連續灌胃7 d，采血前禁食12 h，分別在末次灌胃2 h后，于10%水合氯醛麻醉下腹主動脈采血，4℃冰箱過夜，3 000 r／min離心15 min，分離血清，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝，-20℃冰箱保存備用。

2.2 滑膜細胞獲取 參照文獻［11］完整剝離滑膜組織，簡要步驟如下：2月齡SD大鼠脫臼處死后，膝關節正中縱行切開皮膚，分離肌肉，露出髕骨，繼續向下分離，可見平滑光亮滑膜組織，剪刀分離滑膜層和纖維層，取出滑膜層組織。將獲取的滑膜組織放于裝有含雙抗的生理鹽水中，備用，之后采用Ⅱ型膠原酶消化法獲取滑膜細胞［12］。

2.3 分組與干預 采用4%木瓜蛋白酶注射關節腔的方法建立KOA模型大鼠，空白組為正常大鼠膝關節滑膜細胞，模型組和治療組為KOA模型大鼠膝關節滑膜細胞。空白組與模型組細胞用體積分數10%空白血清培養，治療組用體積分數10%含藥血清培養，干預24 h后檢測相關指標。

2.4 退變軟骨細胞模型 參照課題組前期取材方法，無菌條件下游離并截取4周齡SD膝關節，置入無菌培養皿，帶入超凈工作臺操作。先用PBS充分漂洗，刮除關節周圍附著的肌肉、脂肪等組織后用PBS充分漂洗。用刀片削取每個關節表面的軟骨，PBS充分漂洗軟骨小塊3次，采用酶消化法，消化、獲取正常軟骨細胞［13］，培養、傳代至第三代，再予10 ng／mL的IL-1β誘導24 h，獲得退變軟骨細胞［14］。

2.5 干預 建立退變軟骨細胞模型后，分別更換空白和含藥血清干預后的滑膜細胞上清液，即空白組，用10%空白血清干預后的空白組滑膜細胞上清液培養；模型組，用含10%空白血清干預后的模型組滑膜細胞上清液培養；治療組，用含10%含藥血清干預后的治療組滑膜細胞上清液培養；培養24 h后檢測相關指標。

2.6 ELISA法檢測滑膜細胞上清液SDF-1含量

收取各組滑膜細胞上清液，參照試劑盒說明書測定各組樣本SDF-1含量。

2.7 Real-time PCR法檢測滑膜細胞SDF-1和退變軟骨細胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表達 收集各組細胞，TRIzol法提取總RNA，核酸分析儀檢測各樣本RNA濃度和OD260／280值。根據試劑盒說明書，取1 μg總RNA逆轉錄成cDNA。配置Real-time PCR反應體系：Mix（2×）10 μL，Rox（50×）0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，DEPC水7.8 μL，cDNA 1 μL。引 物 序 列CXCR-4：上 游AACTGAACGCTCCAGAATGT，下游GAGAAACCAC ACAGCACAAC；SDF-1：上游GGCTTTGAGGGAGG GTTT，下游TGCGGAGGAATGACTTCTG；MMP-3：上游5'-GGCACCAGTCAACCTCAA-3'，下游5'-CCAT CTACACAGAGACAGTTACTT-3'；MMP-9：上游5'-GCTGCTCCAACTGCTGTA-3'，下游5'-CATCCAAT AAATTCCTCTGTCCCTA-3'；MMP-13：上游5'-GCT AAGGCAGACATAGTAAGGTAGAT-3'，下游5'-ACA CATCAGTAAGCACCAAGT-3'。擴增條件為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火34 s，持續40個循環，最后95℃15 s、60℃延伸1 min。以β-actin為內參基因，計算各目的基因2-ΔΔCt，比較各目的基因mRNA相對表達水平。

2.8 Western blot法檢測各組滑膜細胞中SDF-1和退變軟骨細胞中CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表達 收集各組細胞，加入含1 mmol／mL PMSF的RIPA裂解液提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上，室溫封閉1 h，分別用SDF-1、CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，滴加ECL顯影液曝光顯影。

2.9 統計學方法 運用SPSS 22.0軟件進行分析。數據符合正態分布，用（±s）表示，采用one-way ANOVA分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Games-Howell法檢驗；不符合正態分布以中位數（四分間距位）表示，采用非參數檢驗。

3 結 果

3.1 3組大鼠滑膜細胞上清液中SDF-1含量比較

見圖1。

圖1 3組大鼠滑膜細胞上清液中SDF-1含量比較

3.2 3組大鼠滑膜細胞SDF-1 mRNA和蛋白表達比較 見圖2、圖3。

圖2 3組大鼠滑膜細胞SDF-1 mRNA表達比較

圖3 3組大鼠滑膜細胞SDF-1蛋白表達比較

3.3 3組退變軟骨細胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白表達比較 見圖4、圖5。

圖4 3組退變軟骨細胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA表達比較

圖5 3組退變軟骨細胞CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白表達比較

4 討 論

OA通常為關節內的局部炎癥常伴隨關節滑膜炎，滑膜通過分泌各類因子進入關節腔內，從而參與調節軟骨及軟骨細胞外基質的代謝活動?；さ姆蚀笸ǔｎA示著關節的炎癥和軟骨及其基質的降解［15］?；た梢苑置诨|降解酶直接參與軟骨細胞外基質的降解，同時可啟動其他軟骨降解的信號通路，使得軟骨破壞［16］。

SDF-1是骨髓基質細胞產生的CXC類趨化蛋白，可由骨髓基質細胞、骨髓內皮細胞等產生［17-18］。SDF-1在人體內有兩種受體，CXCR4和CXCR7。在趨化因子中，SDF-1是CXCR4的唯一配體，KOA患者關節滑膜細胞會分泌SDF-1到滑液中［19］，SDF-1可與軟骨細胞上已存在的CXCR4結合從而影響軟骨細胞的增殖、分化和成熟。有研究指出SDF-1可通過結合軟骨細胞表面的CXCR4受體，從而激活細胞外信號調節酶（Erk）及細胞外信號調節酶相關激酶（p38 MAPK）等信號通路，導致基質金屬蛋白酶（MMP）-3、9、13的合成增加，使得軟骨細胞外基質破壞［19-20］。OA患者關節液中SDF-1的濃度顯著高于健康人，且濃度與嚴重程度成正比［21］。但SDF-1對相關MMP的誘導只對軟骨細胞有效而對滑膜細胞無作用［22-23］?？傊琒DF-1／CXCR4信號通路在KOA患者的病理進程中具有重要作用。

本研究發現OA滑膜細胞上清液中SDF-1含量明顯高于正?；ぜ毎锨逡航M，經過榮筋拈痛方含藥血清干預后SDF-1含量降低。進一步采用Real-time PCR和Western blot法，從基因和蛋白兩個方面檢測滑膜細胞中SDF-1表達情況，發現與空白組相比，模型SDF-1表達明顯增多，而經過榮筋拈痛方含藥血清治療后SDF-1表達量明顯下降。與此同時，本研究同時采用Real-time PCR和Western blot法檢測血清干預后的滑膜細胞上清液對退變軟骨 細 胞CXCR4、MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA和蛋白的影響，結果發現與空白組相比，模型組CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表 達 明 顯 增多，經過滑膜細胞上清液干預后CXCR4、MMP-3、MMP-9和MMP-13表達量明顯下降。可見，榮筋拈痛方可能是通過調節滑膜細胞中SDF-1和軟骨細胞中CXCR4表達，進而調節軟骨細胞中MMP-3、MMP-9和MMP-13表達，起到防治KOA的作用，但是否是唯一途徑，尚需要后期研究進一步驗證。