高效液相色譜法測定烏發護理液中二苯乙烯苷與特女貞苷的含量

何怡靜，李孝棟

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州350122）

烏發護理液由何首烏、女貞子等組成，可用于須發早白等癥［1］。其中君藥何首烏所含的二苯乙烯苷，可誘導酪氨酸酶（TYR）重要轉錄因子的激活，而TYR是黑素形成過程中的主要限速酶，其表達和活性決定著黑素合成的速度和產量［2-8］。因此，二苯乙烯苷是發揮烏發補益作用的主要藥效成分。特女貞苷是女貞子中的特征成分，有研究顯示女貞子提取物對體外培養毛囊的黑素細胞有促進作用［9-10］。黃丹等［11］建立了烏發生發液中二苯乙烯苷的含量測定方法，然而方中所含成分復雜，質量控制指標卻很單一。本研究參考既往文獻［9，12-13］，增加質量控制指標，優化含量測定方法，采用高效液相色譜法同時測定二苯乙烯苷和特女貞苷含量，以控制烏發護理液的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器AR2140電子天平（梅特勒-托利多儀器）；DHG-9240型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；LC-20AT型高效液相色譜儀（島津公司）。

1.2 試藥 二苯乙烯苷（大連美侖生物技術有限公司）；特女貞苷（成都普思生物科技股份有限公司）；乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）；藥材飲片何首烏、女貞子等均購自福州閩侯上街致誠藥店，由福建中醫藥大學中藥鑒定教研室黃澤豪副教授鑒定。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液 精密稱定二苯乙烯苷、特女貞苷對照品適量，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，制成每1 mL含二苯乙烯苷500 μg、特女貞苷1 000 μg的對照品儲備液，低溫避光保存備用。精密吸取4 mL對照品儲備液至10 mL棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取處方量的何首烏、女貞子等藥材，粉碎，加入稀乙醇30 mL，浸泡30 min，加熱回流45 min，放冷，過濾，稀乙醇定容至50 mL，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.3 缺何首烏陰性樣品溶液 取除何首烏之外的處方量藥材，粉碎，精密加入稀乙醇25 mL，浸泡30 min，加熱回流45 min，放冷，補足重量，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.4 缺女貞子陰性樣品溶液 取除女貞子之外的處方量的藥材，粉碎，參照“2.1.3”項下缺何首烏陰性樣品溶液的制備同法操作。

2.2 色譜條件Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（17∶83）；檢測波長：224 nm；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min。

2.3 專屬性考察 在上述色譜條件下，分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液進樣，記錄色譜圖。結果如圖1所示，供試品和對照品溶液的色譜圖在相同的保留時間有一相同的色譜峰，而陰性樣品無干擾。

圖1 專屬性考察色譜圖

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下對照品儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、4.0 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別按“2.2”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）對濃度（X，μg／mL）作圖。二苯乙烯苷峰面積在5～200 μg／mL濃度范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為Y＝17 539X－18 827（r＝0.999 8）。特女貞苷峰面積在10～400 μg／mL濃度范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為Y＝11 563X－31 141（r＝0.999 9）。

2.5 精密度考察 取“2.1.1”項下對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，測定其二苯乙烯苷峰面積RSD為0.80%，特女貞苷峰面積RSD為1.28%，結果表明儀器精密度好。

2.6 穩定性考察 取同一份供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，按“2.2”項下色譜條件測定，二苯乙烯苷峰面積RSD為1.80%，特女貞苷峰面積RSD為1.06%，表明供試品溶液在24 h以內穩定。

2.7 重復性考察 取同一批樣品6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，測得峰面積，并計算得二苯乙烯苷含量RSD為2.30%，特女貞苷含量RSD為3.59%，結果表明方法重復性好。

2.8 加樣回收率考察 精密吸取已知含量的樣品溶液6份，分別精密加入二苯乙烯苷、特女貞苷混合對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加稀乙醇溶解定容至刻度，微孔濾膜濾過，分別按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。結果如表1、表2所示，二苯乙烯苷的平均加樣回收率為102.74%，RSD為0.94%，特女貞苷的平均加樣回收率為104.82%，RSD為0.63%，表明本法準確性好。

表1 二苯乙烯苷加樣回收率考察結果

表2 特女貞苷加樣回收率考察結果

2.9 烏發護理液樣品含量測定 取3批樣品，按照“2.2”項下色譜條件，測定二苯乙烯苷及特女貞苷峰面積，代入標準曲線計算，結果見表3。

表3 烏發護理液樣品含量測定mg／g

3 討 論

特女貞苷在224 nm處有最大吸收，二苯乙烯苷在224 nm和320 nm處均與較強吸收，因此，選擇224 nm作為檢測波長［9］。

本方法采用C18色譜柱，流動相選為乙腈-水（17∶83），檢測波長為224 nm，進樣量為10 μL，柱溫為30℃，流速為1.0 mL／min，可以快速測定烏發護理液中二苯乙烯苷和特女貞苷的含量，靈敏度高，專屬性強，重復性好，可以控制烏發護理液質量標準，還可為含有何首烏和女貞子的制劑建立質量標準提供參考。