牛胚胎移植技術產業化推廣模式探索

□文/李樹靜 王志仙 馮春濤 藺惠良 劉玉 趙增元 朱宏波 張普 孫貴來 余文莉

家畜胚胎移植技術（ET），尤其是牛胚胎移植技術經過幾十年的研究日趨成熟并在生產中得到了廣泛的應用，成為家畜育種和快速擴繁的重要技術方法。牛胚胎移植技術是加速遺傳進展及在國家和國際上引種的重要工具。同時，將胚胎冷凍保存有助于保護現有的遺傳資源。目前，可移植胚胎通過在體內超數排卵和胚胎采集（MOET）及活體采卵體外受精（OPU-IVF）獲得。無論是MOET還是OPU-IVF技術，大量胚胎的產生依賴于對供體母牛使用促卵泡激素（FSH）進行卵巢超數排卵處理。世界上每年大約產生130萬余枚胚胎，超過90%的經過基因選擇模式獲得的種公牛來自胚胎移植。2002年至今，作者團隊累計對全國25個省市自治區293家企業、事業及個體養殖戶進行荷斯坦奶牛及各品種純種肉牛的胚胎生產和移植，包括奶肉牛進口與自產常規冷凍胚胎、奶牛PCR性別鑒定凍胚及鮮胚及X精子性控胚胎的移植，累計生產高產奶牛胚胎139788枚，移植66570頭次，生產純種肉牛胚胎18013枚，移植10965頭。

供體牛超排反應和優質胚胎數量的差異是制約牛胚胎移植技術發展的一個主要問題，移植妊娠率的波動也會影響其推廣的接受度。在奶牛上，該技術還受到胚胎性別的制約。對供體牛胚胎生產能力評估、提高胚胎性別鑒定技術效率和受體牛移植妊娠率有助于該技術的推廣應用。

供體母牛胚胎生產能力的差異性分析

如表1所示，對980頭12月齡以上荷斯坦奶牛連續4年重復超排，期間將連續3次可用胚胎數低于3枚的供體牛停止沖胚，根據停止超排時所獲得的可用胚胎總數和沖胚次數分組，每組98頭，共分為10組。結果表明，排名前30%的供體牛沖胚的次數占總沖胚次數的60.22%，可用胚胎數占總可用胚胎的73.07%；排名后30%的供體牛沖胚的次數占總沖胚次數的10.33%，可用胚胎數占總可用胚胎的3.86%。隨著排名次數的下降，沖胚次數和平均可用胚數相應下降。排名前30%與后30%的供體牛，平均超排次數（14.59vs2.5）、平均采胚數（11.66vs4.78），以及平均可用胚數（7.36vs2.27）均差異極顯著。

如表2示，獲得可用胚胎最多的10頭供體牛，頭均超排36.3次，可用胚胎392.7枚，每次沖胚可用胚胎10.82枚/頭，其中獲得可用胚胎最多的供體牛連續超排46次，獲得可用胚胎568枚，平均每次獲得可用胚胎12.35枚。

表1 供體母牛胚胎生產能力的差異性分析Table 7 Analysis on the difference of embryo production capacity of donor cows

表2 荷斯坦奶牛連續沖胚可用胚胎數量TOP-10Table 8 The number of embryos available for continuous embryo flushing of Holstein cows is top-10

表3 荷斯坦奶牛連續沖胚可沖胚次數TOP-10Table 9 Top-10 times of continuous embryo washing in Holstein cows

如表3所示，沖胚次數最多的10頭供體牛，頭均超排41.3次，可用胚胎341.7枚，每次沖胚可用胚胎8.27枚/頭，其中最高的供體牛連續超排了48次，獲得可用胚胎269枚。

選擇性重復超數排卵的作用

選擇連續超排次數大于等于6次的供體470頭，分別統計每頭供體1～3次、2～4次、3～5次的平均可用胚數作為自變量，每頭供體牛第4、5、6次的可用胚數作為因變量，超強度重復超排前3次與后3次的可用胚數存在弱正相關，相關系數為0.13。見圖1。

圖1 選擇性重復超數排卵Fig.3 Selective Repeated Superovulation

種公牛凍精對超排結果的影響

表4 不同種公牛凍精的胚胎生產能力比較Table 10 Comparison of embryo production capacity of different kinds of bull frozen semen

對2016-2020年所使用的21頭供體牛輸精頭數達100頭以上的荷斯坦種公牛凍精進行胚胎生產效果的評估。如表4所示，不同凍精可用胚率在54%-67%之間，總體平均62.23%。通過不同公牛凍精的可用胚胎比例與未受精卵率關聯分析，如圖2所示，在平均獲得未受精卵比例和可用胚胎比例方面存在弱相關性，R2=0.4405。

凍精 沖胚 未受精 退化 可用 回收 未受精卵可用胚號 頭數 均數 均數 均數 均數 比例 比例31911.722.357.6011.6714.76%65.14% 41142.241.627.0610.9320.53%64.63% 51631.651.465.638.7418.88%64.43%63651.531.775.909.2016.62%64.16%71081.062.075.608.7312.09%64.16%82441.571.405.308.2718.95%64.13%91061.402.637.1411.1712.50%63.94%105372.101.836.8210.7419.53%63.47%113101.461.775.508.7316.75%62.96%122682.151.566.219.9221.69%62.62%134351.711.385.108.1920.90%62.31%144842.431.626.5710.6222.92%61.85%154531.801.665.418.8720.29%61.01%167812.311.806.3310.4522.14%60.63%172371.542.406.039.9715.42%60.51%183981.572.375.999.9415.82%60.30%191881.671.364.447.4822.37%59.40%201062.302.205.9210.4322.07%56.80%212213.382.517.0312.9226.14%54.40%合計62931.861.806.029.6819.21%62.23%

圖2 不同公牛凍精未受精卵與可用胚比例關系Fig.4 Relationship between unfertilized eggs and available embryos in different frozen semen of bulls

季節變化對超排效果的影響

對2015～2020年河北省12587頭次荷斯坦奶牛育成牛（12～15月齡）超排反應隨季節的變化進行分析。平均總胚數和可用胚胎數隨季節的變化波動一致，4、5、12月份的平均總胚數和可用胚胎數極顯著或顯著高于其它月份，而8、9月份的平均總胚數和可用胚胎數極顯著或顯著低于其它月份，詳見圖3和表5。平均未受精卵數8月份極顯著低于3月份（P＜0.01），退化胚胎數9月份顯著低于5月份（P＜0.05），其余月份差異不顯著。

表5 沖胚月份對沖胚效果影響Table 11 Effect of the month of embryo flushing on the effect of embryo flushing

不同的大寫字母間差異極顯著（P＜0.01）；不同的小寫字母間差異極顯著（P＜0.05）

圖3 沖胚月份對沖胚效果影響Fig.5 Effect of the month of embryo flushing on the effect of embryo flushing

性別鑒定胚胎的移植妊娠率和產犢準確率

在奶牛場，應用胚胎性別鑒定技術可增加所期望性別的后代數量并節省受體成本，保證以最低的成本獲得所需性別的犢牛。胚胎性別鑒定已被證明能優化受體的

表6 性別鑒定胚胎的移植妊娠率和產犢準確率的分析Table 12 Analysis of pregnancy rate and calving accuracy of sex identification embryo transfer

不同的大寫字母間差異極顯著（P＜0.01）；不同的小寫字母間差異極顯著（P＜0.05）。

*僅統計客戶準確記錄并反饋了犢牛性別的犢牛頭數。**受體牛均為荷斯坦育成牛或黃牛，用CIDR-PG法進行同期發情處理。

表7 產后母牛雙同期首配實施雌性胚胎移植對年度產母犢率的影響（2019.7～2020.6）Table 13 Effect of female embryo transfer on the annualcalving rate of postpartum cows（July 2019 to June 2020）

不同的大寫字母間差異極顯著（P＜0.01）。奶牛產后65±3天和72±3天分別用常規凍精人工授精或用雌性胚胎移植。利用。如表6所示，PCR胚胎性別鑒定技術雌性率極顯著高于常規凍胚，但移植妊娠率顯著低于后者（P＜0.05）。如表7所示，該基地近1年雌性胚胎移植占經產牛參配牛的42.47%，雌性胚胎準確率99.29%，年度產母犢率極顯著高于單純使用常規凍精輸精（68.96%vs51.05%）。

季節對受體母牛移植妊娠率的影響

對2003～2019年全部移植數據分析，10月份移植妊娠率顯著低于4、6、7、9月，其余月份差異不顯著。

圖4 不同月份對受體移植效果的影響Fig.6 The effect of different months on recipient transplantation

自然發情和同期發情的效果分析

如表8所示，盡管自然發情的受體牛移植妊娠率低于同期發情牛，但因其利用率極顯著高于后者，因此以處理牛計算其受胎率顯著高于同期發情牛。

產后奶牛首配實施胚胎移植的效果

如圖5所示，對產后奶牛用雙同期-定時輸精程序處理，分別在產后65±3天和72±3天用常規凍精人工授精或用雌性胚胎移植，各月份及年度總移植妊娠率和人工授精發情期受胎率之間均無顯著差異（總計：42.33%vs43.28%）。

圖5 產后奶牛首配實施胚胎移植的效果Fig.7 Effect of embryo transfer on postpartum cows

未來10年，我們仍以體內胚胎產業化應用為主，并加大OPU-IVF技術研發與推廣力度，提高效率，最終形成可與現有體內胚胎性別鑒定技術體系相媲美的牛體外性控胚胎生產技術體系。

表8 自然發情和同期發情的效果分析Table 14 Effect analysis of natural estrus and synchronous estrus

馬亞賓團隊成員查看剛采集的奶牛卵細胞

奶牛活體采卵作業