下調LINC00667靶向調控miR-34a抑制口腔鱗癌CAL-27細胞增殖并誘導細胞凋亡的體外研究

彭國棟 裴磊

口腔癌是頭頸部惡性腫瘤中的一大類，口腔癌中有約90%為口腔鱗癌，其發生涉及煙草、酒精刺激、病毒感染、免疫異常等多個因素[1]。口腔鱗癌的發生是一個多步驟、多基因共同作用的結果，其具體的發生機制還不明確[2]。積極尋找有效的分子標記物對于口腔鱗癌的治療意義重大[3]。LncRNA是長度大于200 bp的非編碼RNA，其可以在轉錄后、翻譯水平調控基因的表達，參與多個細胞生理和病理過程[4]。很多研究表明，LncRNA與人類多種疾病有關，如動脈粥樣硬化、哮喘、腦出血等，LncRNA可能是疾病治療的分子靶點[5-7]。LINC00667是近些年來發現的具有調控腫瘤進展作用的調節因子，其在膠質瘤中發揮促進作用[8]。LINC00667在結直腸癌中表達上調，下調LINC00667抑制結直腸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[9]。LncRNA作用機制與miRNA有關，其可以通過調控miRNA的表達參與多個生理過程[10]。前期的預實驗發現LINC00667和miR-34a存在互補結合位點。miR-34a在口腔鱗癌中發揮抑制作用，其能夠下調腫瘤細胞的增殖能力，誘導細胞凋亡[11]。本實驗探討下調LINC00667靶向調控miR-34a對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡的影響，為靶向分子治療口腔鱗癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

cyclin D1抗體、p27抗體(碧云天生物技術有限公司)；口腔鱗癌細胞CAL-27(廣州賽庫生物技術有限公司)；C-Caspase-3抗體(北京百奧萊博科技有限公司)；mimics control、miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、inhibitor control(上海吉瑪制藥技術有限公司)；口腔鱗癌細胞SCC15(南京科佰生物科技有限公司)；口腔鱗癌細胞OSC-4(上海弘順生物科技有限公司)；shRNA control、LINC00667 shRNA(上海基爾頓生物有限公司)；正常口腔上皮細胞HOK(上海榕柏生物技術有限公司); Light Cycler 480熒光定量PCR儀(Roche公司，美國)；Multiskan FC酶標儀(Thermo公司，美國)；FACS caliber流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2 口腔鱗癌細胞中LINC00667表達的檢測

收集正常口腔上皮細胞HOK和口腔鱗癌細胞CAL-27、SCC15、OSC-4，按試劑盒說明，Realtime PCR方法檢測各細胞系中LINC00667的表達，內參設置為GAPDH，按照2-△△Ct法計算LINC00667表達水平。

1.3 CAL-27細胞轉染及分組

將CAL-27細胞分為Control、sh-NC、sh-LINC-00667組，sh-NC、sh-LINC00667組，按照轉染試劑說明分別轉染shRNA control、LINC00667 shRNA，Control組為沒有進行細胞轉染的口腔鱗癌細胞CAL-27。收集轉染48 h以后的各組細胞，利用Realtime PCR方法檢測細胞中LINC00667表達水平。

1.3.1 CAL-27細胞增殖檢測 在96 孔板中接種口腔鱗癌CAL-27細胞，按照Control、sh-NC、sh-LINC-00667組分組方法處理培養48 h。常規MTT法檢測，以A值表示細胞增殖活性。

1.3.2 CAL-27細胞周期檢測 收集各組細胞，常規PI染色，用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.3.3 CAL-27細胞凋亡檢測 收集各組細胞Annexin V-FITC方法染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.4 CAL-27細胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達檢測 收集各組細胞，Western blot方法檢測3 種目標蛋白表達。GAPDH作為參照，分析目的蛋白的相對表達水平。cyclin D1、p27一抗按照1∶1 000稀釋，C-Caspase-3按照1∶600稀釋。

1.4 靶基因預測及鑒定

利用生物信息學軟件Starbase分析LINC00667的靶基因，以熒光素酶報告系統鑒定二者的靶向關系。分別把WT、MUT與mimics control、miR-34a mimics共轉染到CAL-27細胞中，培養48 h后，利用熒光素酶活性測定試劑盒分析細胞熒光素酶活性的變化。WT為含有LINC00667結合位點的野生型熒光素酶報告載體，MUT為含有突變之后LINC00667結合位點的突變型熒光素酶報告載體。收集轉染48 h以后的Control、sh-NC、sh-LINC00667組細胞，利用Realtime PCR方法檢測細胞中miR-34a表達水平，內參為U6。

1.5 miR-34a inhibitor對下調LINC00667影響口腔鱗癌細胞作用檢測

CAL-27細胞中共轉染miR-34a inhibitor、LINC00667 shRNA和inhibitor control、LINC00667 shRNA，命名為sh-LINC00667+Anti-miR-34a和sh-LINC-00667+Anti-miR-NC組，細胞培養48 h后，利用MTT實驗檢測細胞增殖，PI染色法檢測細胞周期，Annexin V-FITC方法檢測細胞凋亡， Western blot方法檢測細胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達，Realtime PCR方法檢測miR-34a表達。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 口腔鱗癌細胞中LINC00667相對高表達

口腔鱗癌細胞CAL-27、SCC15、OSC-4中LINC00667表達水平均高于正常口腔上皮細胞HOK(P<0.05)，OSC-4、SCC15中LINC00667表達水平均低于CAL-27(P<0.05)(表 1)。口腔鱗癌細胞中LINC00667相對高表達，選取表達水平最高的CAL-27用于后續實驗。

表 1 各細胞系中LINC00667表達水平

2.2 下調LINC00667對口腔鱗癌細胞增殖、周期和凋亡影響

與Control、sh-NC組比較，sh-LINC00667組CAL-27細胞中LINC00667水平降低，細胞增殖活性下降，細胞G0/G1期比例升高，細胞凋亡率升高，細胞中cyclin D1蛋白表達減少，p27、C-Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖 1,表 2)。下調LINC00667抑制口腔鱗癌細胞增殖并阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡。

圖 1 LINC00667 shRNA對CAL-27細胞凋亡和細胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達影響

表 2 LINC00667 shRNA轉染對CAL-27細胞相關生物學特性的影響

2.3 LINC00667和miR-34a為靶向關系

生物信息學軟件預測LINC00667和miR-34a存在互補結合位點，并且miR-34a mimics和WT共轉染之后的細胞熒光素酶活性降低(圖 2,表 3)。LINC00667和miR-34a為靶向關系。

圖 2 LINC00667和miR-34a結合位點

表 3 熒光素酶活性

2.4 下調LINC00667促進miR-34a表達

與Control、sh-NC組比較，sh-LINC00667組CAL-27中miR-34a水平升高(P<0.05)(表 4)。下調LINC00667促進miR-34a表達。

表 4 下調LINC00667后CAL-27細胞中miR-34a水平

2.5 miR-34a inhibitor對下調LINC00667影響口腔鱗癌細胞CAL-27增殖、周期和凋亡的作用

與sh-LINC00667+Anti-miR-NC組比較，sh-LINC00667+Anti-miR-34a組口腔鱗癌細胞CAL-27中miR-34a水平降低，細胞增殖活性升高，細胞G0/G1期比例降低，細胞凋亡率降低，細胞中p27、C-Caspase-3蛋白表達水平降低，cyclin D1蛋白表達水平升高(P<0.05)(圖 3,表 5)。

圖 3 miR-34a inhibitor對下調LINC00667影響CAL-27細胞凋亡和細胞中cyclin D1、p27、C-Caspase-3蛋白表達影響

表 5 miR-34a inhibitor和LINC00667 shRNA轉染對CAL-27細胞相關生物學特性的影響

3 討 論

LncRNA具有十分強大的調控潛力，LncRNA能夠從DNA甲基化、基因組印記、mRNA降解、蛋白質定位等多個層面發揮作用，其與神經退行性疾病、心血管系統疾病、腫瘤等發生有關，參與胚胎發育、能量代謝、細胞分化，LncRNA目前已經成為研究的重點領域[12]。有研究發現，LINC00667與腫瘤進程有關，LINC00667在非小細胞肺癌中表達上調，LINC00667促進肺癌細胞惡性增殖[13]。下調LINC00667誘導結直腸癌細胞凋亡，降低結直腸癌細胞增殖速度[9]。本實驗發現，LINC00667在口腔鱗癌細胞中過度表達，并且下調LINC00667抑制口腔鱗癌細胞增殖能力，這說明LINC00667在口腔鱗癌中可能發揮類似癌基因的作用，這與以前的研究結果一致，均提示LINC00667可能具有促進腫瘤的作用。

細胞周期有序進展是細胞增殖的基礎，而細胞增殖和細胞凋亡動態平衡是機體穩態維持的關鍵[14]。細胞周期是指從上一次細胞分裂結束到本次細胞分裂結束的整個過程，其包括分裂期和分裂間期，細胞周期是一個復雜過程，受到多個基因的共同調控作用[15]。G0/G1向S期進展是細胞周期調控中的關鍵點之一，cyclin D1可以促進細胞進入S期，cyclin D1也被認為是細胞周期進程加快的標志[16]。另外，cyclin D1也是目前發現的在腫瘤中表達上調的促腫瘤因子[17]。p27是細胞周期的抑制因子，其表達水平升高，細胞周期被阻滯[18]。Caspase蛋白家族含有多個蛋白成員，這些蛋白成員以沒有活性的形式在細胞內存在，只有被活化后才可以發揮促進細胞凋亡的功能[19]。Caspase-3是Caspase蛋白家族中的凋亡執行因子，其在凋亡級聯反應中處于下游，Caspase-3被激活后可以不可逆的誘導細胞凋亡[20]。本實驗表明，下調LINC00667后的口腔鱗癌細胞G0/G1期比例升高，cyclin D1蛋白表達減少，p27、C-Caspase-3蛋白表達水平升高，細胞凋亡率升高，這提示下調LINC00667阻滯細胞周期并誘導細胞凋亡，這進一步證明了LINC00667可能是一種癌基因。

目前對LncRNA的作用機制的研究較多，但尚未完全闡明，目前研究較多的是LncRNA通過與miRNA結合影響miRNA的表達進而調控細胞生理功能，并且LncRNA和miRNA通過堿基互補的方式結合，因此同一個LncRNA可以同時調控多個miRNA，而同一個miRNA能夠同時被多個LncRNA調控[21]。本實驗發現，下調LINC00667能夠靶向促進miR-34a的表達。miR-34a位于1p36.22染色體上，其在大多數器官中均有表達。有研究已經證明，miR-34a在宮頸癌、乳腺癌、口腔鱗癌等多個腫瘤組織中表達下調，miR-34a在腫瘤細胞生長中發揮抑制作用[11,22-23]。本實驗顯示，下調miR-34a具有逆轉下調LINC00667對口腔鱗癌細胞增殖、周期和凋亡作用的功效，這說明下調LINC00667通過靶向miR-34a發揮作用。

綜上，LINC00667可能是一個口腔鱗癌促進因子，下調其表達體外抑制口腔鱗癌細胞增殖，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，機制與靶向miR-34a有關。目前尚未研究LINC00667調控miR-34a的下游靶向機制，尚未在多株口腔鱗癌以及體內驗證LINC00667的作用，在后續實驗中會對這些內容進行探討。本次實驗為靶向分子治療口腔鱗癌提供了思路，為研究口腔鱗癌的分子發生機制提供了部分資料。