凝結芽孢桿菌對畜禽腸道有害菌及有益菌的抑菌性能研究

王雪艷，肖明霞，王乙茹，柳成東，趙 平，王春羲，屈 娥*，程志斌*

（1.云南農業大學，昆明 650201；2.達州職業技術學院，四川 達州 635001；3.昆明三正生物科技（集團）有限公司，昆明 650217）

自2020年7月1日我國飼料與養殖業全面禁止促生長藥物飼料添加劑的使用以來，飼用益生菌等功能性“替抗”飼料添加劑的評估與應用技術受到行業高度關注[1-2]。凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）兼具乳酸類益生菌的抑菌作用和芽孢桿菌屬益生菌的良好耐熱性，因此近年來成為行業替代飼用抗生素應用與研究的焦點[3-5]。目前，大部分文獻表明凝結芽孢桿菌能夠顯著改善畜禽生長性能[6-13]，但也有少數報道顯示飼糧添加凝結芽孢桿菌對畜禽生長性能沒有明顯的改善作用[14-18]。以上飼養試驗報道的矛盾提示，評估凝結芽孢桿菌對畜禽生產性能的飼養試驗易受試驗動物、養殖條件、試驗設計等諸多因素的干擾[5,19]，且飼養試驗周期長、研究經費高。因此，建立體外科學、高效的實驗室評估方法與技術有助于益生菌產品的初步篩選。

抑菌性能是飼用益生菌平衡畜禽腸道菌群、促進生產性能的重要機制之一[3-5]。因此，針對畜禽腸道主要有害菌及有益菌，采用體外抑菌試驗技術評估凝結芽孢桿菌的抑菌性能，能夠驗證飼用凝結芽孢桿菌在畜禽體內發揮平衡腸道菌群、促進生長的確切作用效果。常用的體外抑菌試驗法包括：牛津杯法[20-21]、最小抑菌濃度法[22]、殺菌能力法[23]、平板劃線法[24]等。其中，牛津杯法常用于各類抗生素及益生菌的抑菌性能評估[20-21,25]。據此，本研究以廣譜飼用抗生素土霉素為參照，開展一株凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌及有益菌的抑菌作用評估，以期驗證以往飼用凝結芽孢桿菌對畜禽生產性能的作用效果。

1 材料

凝結芽孢桿菌（菌株編號為YNAU 5517），從云南省西雙版納州景洪市農村散養茶花雞的腸道獲得[26]；土霉素，購買于昆明三正生物科技（集團）有限公司；抑菌試驗的7個指示菌，包括大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大腸桿菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）、產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringensCVCC2027）、羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、嗜熱雙歧桿菌（Bifidobacterium thermophilusATCC25525），購自北納創聯生物科技有限公司。

2 方法

2.1 試驗設計

本研究設計3個處理組，分別為陰性對照（無菌蒸餾水）組、陽性對照組（土霉素）、凝結芽孢桿菌組。采用牛津杯法對比評估凝結芽孢桿菌對以上2類（腸道有害菌、腸道有益菌）7個指示菌的抑制效果。土霉素的濃度依據《飼料藥物添加劑使用規范》中全價配合飼料允許添加量范圍的上限配制成400 mg·L-1溶液。

2.2 抑菌試驗

2.2.1 凝結芽孢桿菌及指示菌的培養

（1）凝結芽孢桿菌的培養，參照柳成東等[25]的報道。（2）指示菌大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、豬霍亂沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的培養，采用LB培養基（酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸餾水1 000 mL）。指示菌產氣莢膜梭菌的培養采用血營養培養基（牛肉膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、蒸餾水1 000 mL、10%的無菌脫脂纖維羊血）。（3）指示菌羅伊氏乳酸桿菌采用MRS培養基（蛋白胨20.0 g、酵母粉10.0 g、葡萄糖5.0 g、NaCl 2.5 g、K2HPO42.0 g、MgSO41.0 g、番 茄 汁50.0 mL、蒸餾水1 000 mL）。指示菌嗜熱雙歧桿菌采用BBL培養基（蛋白胨15.0 g、酵母膏粉2.0 g、葡萄糖20.0 g、可溶性淀粉0.5 g、氯化鈉5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、1.0 mL吐溫-80、肝浸粉2.0 g、蒸餾水1 000 mL）。

2.2.2 指示菌涂布平板制備

將指示菌涂布平板的MRS培養，于121℃滅菌30 min后冷卻至50℃，倒入培養皿（25.0～30.0 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

2.2.3 指示菌液稀釋涂布

（1）將培養24 h的豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌、產氣莢膜梭菌的菌液吸取800 μL，轉入裝有7.2 mL無菌水的EP管中，進行梯度稀釋，選取稀釋梯度為10-4作為涂布菌液。每次操作每個指示菌涂3個培養皿（3次平行測定）。

（2）將培養24 h的羅伊氏乳酸桿菌菌液吸取800 μL，轉入裝有7.2 mL無菌水的EP管中，進行梯度稀釋，選取稀釋梯度為10-3作為涂布菌液。每次操作每個指示菌涂3個培養皿（3次平行測定）。

（3）將培養24 h的嗜熱雙歧桿菌菌液作為涂布菌液。每次操作每個指示菌涂3個培養皿（3次平行測定）。

2.2.4 牛津杯法抑菌性能測定

為了統計比較3個處理組（無菌蒸餾水組、土霉素組、凝結芽孢桿菌組）對同一指示菌的抑制作用，每個指示菌吸取200 μL涂布一個培養皿，每個培養皿中放置3個牛津杯，分別加入100 μL的無菌蒸餾水、土霉素、凝結芽孢桿菌菌液。然后恒溫培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑（DIZ）的最大值與最小值，以二者的平均值確定抑菌圈直徑的數據。

2.3 抑菌作用的判定方法

抑菌作用的判定方法參考李靜舒等[27]的報道。為了對3個處理組的抑菌圈直徑進行方差分析，將沒有抑制作用的抑菌圈直徑值定義為7.8 mm。并依據本試驗所用牛津杯的直徑值（7.8 mm）將牛津杯外徑約2倍16.0 mm區分為敏感與高敏感，因此抑菌作用判定標準如下：DIZ=7.8 mm，不敏感；7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm，敏感；DIZ＞16.0 mm，高敏感。

2.4 統計方法

以上抑菌試驗重復操作3次，3個處理組的DIZ數據采用單因素方差分析和LSD法進行多重比較，用SPSS軟件進行統計分析，P＜0.05表示差異顯著。

3 結果與分析

3.1 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用

測定凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制情況，結果見表1和圖1。

表1 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的DIZ mm

由表1和圖1可知，該株凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用達到高敏感（DIZ＞16.0 mm），對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌和產氣莢膜梭菌等抑制作用均為敏感（7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm）。陽性對照組土霉素對以上指示菌的抑制作用均達到高敏感，且抑制效果顯著高于凝結芽孢桿菌（P＜0.05）。此外，陰性對照組無菌蒸餾水對以上指示菌的抑制作用均為不敏感（DIZ=7.8 mm）。

圖1 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌的抑制情況

3.2 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制作用

測定凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制情況，結果見表2和圖2。

由表2和圖2可知，凝結芽孢桿菌對羅伊氏乳酸桿菌、嗜熱雙歧桿菌的抑制作用均為不敏感；陽性對照組土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用達到高敏感，對嗜熱雙歧桿菌的抑制作用為不敏感。此外，無菌蒸餾水對羅伊氏乳酸桿菌和嗜熱雙歧桿菌的抑制作用均為不敏感。

表2 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的DIZ mm

圖2 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌的抑制情況

4 討論

4.1 凝結芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制作用

雞白痢沙門氏菌是誘發家禽腸道疾病的主要致病菌之一，感染雞白痢沙門氏菌致使家禽嚴重腹瀉，顯著降低生產性能[28]。本研究首次證明，凝結芽孢桿菌對雞白痢沙門氏菌的抑制作用良好，達到敏感水平，提示該株凝結芽孢桿菌可用于家禽飼糧添加或腸道保健品預防雞白痢沙門氏菌感染。

豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌K88及K99、產氣莢膜梭菌等是導致豬雞細菌性腹瀉、死亡率高的主要致病菌，對養殖生產危害嚴重[29-31]。本研究結果表明凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制達到高敏感水平，這與嚴濤等[32]報道一致，提示該株凝結芽孢桿菌可用于豬飼糧添加或腸道感染的治療藥物。誠然，這一推測有待于進一步的動物試驗驗證。此外，凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99和產氣莢膜梭菌的抑制作用均為敏感，這一結果與前人報道一致[32-35]。

4.2 凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌抑制作用

乳酸桿菌和雙歧桿菌是畜禽腸道的優勢有益菌，對維持腸道菌群平衡、保障畜禽生長性能有著重要作用[36-37]。目前，沒有體外試驗評估凝結芽孢桿菌對乳酸桿菌、雙歧桿菌等腸道有益菌抑制作用的報道。鑒于以往大量文獻[38-39]證明飼用廣譜抗生素對畜禽腸道有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的負面影響，本研究首次開展了凝結芽孢桿菌對乳酸桿菌、雙歧桿菌的體外抑菌作用評估。本試驗選用了腸道乳酸桿菌的代表指示菌羅伊氏乳酸桿菌以及雙歧桿菌的代表指示菌嗜熱雙歧桿菌，因為這兩株菌在畜禽腸道中占比較高[36-37]。

本研究首次發現，凝結芽孢桿菌對羅伊氏乳酸桿菌、嗜熱雙歧桿菌無抑制作用（不敏感）。這一結果提示飼糧使用凝結芽孢桿菌替代廣譜抗生素，能夠避免抗生素對畜禽腸道有益菌的不利影響，這可能是飼用凝結芽孢桿菌進一步優化腸道菌群、保障畜禽生產性能的重要機制之一。M.K.Bami等[40]研究顯示，與抑菌藥物氧化鋅比，飼用凝結芽孢桿菌有效降低肉雞腸道大腸桿菌數量，顯著增加了乳酸桿菌的數量，從而保障了肉雞正常的生長性能。黃遵錫等[41]報道，與飼用抗生素組比，凝結芽孢桿菌組肉雞腸道的大腸桿菌數量顯著下降，乳酸桿菌數量顯著上升，從而保障了斷奶仔豬正常的生長性能。以上體外抑菌試驗與飼養試驗檢測腸道菌群變化的結果相符，表明體外牛津杯抑菌試驗技術適合科學、高效地選用凝結芽孢桿菌等功能性添加劑產品，以解決替抗類功能性添加劑在動物飼養試驗中試驗周期長、可重復性差、試驗成本高等問題。

5 結論

本研究采用體外牛津杯法評估了一株凝結芽孢桿菌對畜禽主要腸道有害菌及有益菌等7個指示菌的抑制作用，首次發現凝結芽孢桿菌對腸道有害菌雞白痢沙門氏菌有較好抑制作用，且對腸道有益菌乳酸桿菌、雙歧桿菌無抑制作用。本研究體外抑菌試驗技術可為廣大飼料企業科學、高效地選用凝結芽孢桿菌等飼用益生菌提供借鑒。