甘藍黑腐病苗期抗性鑒定方法研究

張鑫鑫 張恩慧 吳云鋒 許忠民 蔡美杰 孫慶國

摘? ? 要：為了建立快速、準確的甘藍黑腐病苗期抗性鑒定方法，以田間對黑腐病抗感差異表現明顯的5個供試材料作為鑒別寄主，噴霧接種黑腐病菌株，設置1葉1心、2葉1心、3葉1心、4葉1心、5葉1心等5個接種苗齡，1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4種菌液接種濃度，26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、30 ℃/19 ℃等3種培養溫度，接種后0、12、24、36、48 h等5個保濕時間及接種后7、9、12、16 d等4個時間分別調查發病癥狀，確定影響抗性鑒定方法的關鍵因子。結果表明，上述處理組合能反映5個寄主材料的抗感特性，且高感與高抗材料的病情指數差值最大的分別為73.61、74.77和72.22。當甘藍幼苗生長至3葉1心期，噴霧法接種濃度為1×108 CFU·mL-1菌液，接種后90%濕度下保濕36 h，在14 h光照、溫度26 ℃/19 ℃培養下誘導病害發生，第12天調查幼苗發病程度，能夠鑒定甘藍材料的抗病性。

關鍵詞：甘藍;黑腐病;抗病性;苗期;鑒定方法

中圖分類號：S635 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）06-039-08

Study on the method of identification of resistance to black rot in cabbage at seedling stage

ZHANG Xinxin1， ZHANG Enhui1， WU Yunfeng2， XU Zhongmin1， CAI Meijie1， SUN Qingguo1

（1. State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Horticulture， Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China; 2. College of Plant Protection，Northwest A&F University， Yangling 712100， Shaanxi， China）

Abstract： In order to establish a rapid and accurate method for identification of resistance to black rot in cabbage at the seedling stage， we used 5 materials with significant differences in resistance to black rot in the field as identification hosts， sprayed inoculation with black rot strains， set 5 inoculation seedling ages （one leaf and one heart， two leaves and one heart， three leaves and one heart， four leaves and one heart， five leaves and one heart）， 4 kinds of inoculation concentrations （1×105 CFU·mL-1， 1×106 CFU·mL-1， 1×108 CFU·mL-1， 1×1010 CFU·mL-1）， 3 culture temperature treatments （26 ℃/19 ℃， 28 ℃/19 ℃， 30 ℃/19 ℃）， 5 moisturizing times （0 h， 12 h， 24 h， 36 h， 48 h） and 4 investigation time （7 d， 9 d， 12 d， 16 d） to determine the key factors of the identification method. The results show that the above treatment combination can reflect the anti-susceptibility characteristics of the five host materials， and the difference between the disease indices of the high-sensitivity and high-resistance materials is 73.61， 74.77 and 72.22， respectively. When the seedlings grew to the three leaves and one heart stage， the bacterial suspension with a concentration of 1×108 CFU·mL-1，was inoculated by spraying method， moisturized at 90% humidity for 36 hours after inoculation， and the disease was induced under 14 h light and 26 ℃/19 ℃， the incidence of seedlings was investigated on the 12th day， the disease resistance of cabbage material could be identified.

Key words： Cabbage; Black rot; Resistance; Seedling stage; Identification method

甘藍黑腐病是由野油菜黃單胞菌（Xanthomonas Campestris pv. campestris，Xcc）引起的一種細菌性病害[1]，是亞洲、歐洲、北美洲十字花科蔬菜的主要病害[2-4]。病斑從葉片邊緣的褪綠斑點逐漸向葉片的主脈擴張，形成“V”形病斑，顏色從黃色逐漸變為褐色，最后變為黑色[5]。甘藍黑腐病野油菜黃單胞菌主要通過種子帶菌和幼苗移植進行傳播，也可以通過昆蟲、灌溉用水、農場設備及工人進行農事活動等進行傳播[6]。病菌也能在十字花科雜草寄主和土壤中受感染的作物殘茬中存活[7-8]。亞熱帶許多蔬菜生產區典型的溫暖潮濕氣候有利于疾病的流行[9]。

近年來，甘藍黑腐病在我國蔬菜主產區普遍發生，對甘藍生產造成了很大危害，使甘藍嚴重減產[10]。盡管市場上有一些用于防治黑腐病的農藥，但由于病原菌對殺菌劑的抗藥性，黑腐病很難得到控制[11]，選育抗病品種是防治甘藍黑腐病最經濟有效的途徑之一，因此依據甘藍黑腐病發生條件、發病規律和作物的感病特性、發病特征，制定一套較為科學的苗期抗病性鑒定方法，對于抗源篩選和抗病品種選育非常重要。有研究表明，甘藍苗期和成株期抗病性基本一致[12-13]，苗期鑒定抗病性速度快，可在較短時間內得到鑒定結果，并且苗期鑒定可在室內進行，條件容易控制[14-16]。因此，筆者在前人研究的基礎上，從甘藍幼苗接種黑腐病菌保濕時間、病原菌接種濃度及溫度、甘藍接種苗齡和調查時間等主因入手進行探究，旨在進一步完善并制定出甘藍黑腐病苗期抗病性鑒定方法，以期為甘藍抗病育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

供試甘藍材料為甘藍田間黑腐病自然病圃經多年抗病性自然鑒定表現對黑腐病菌抗感差異顯著的5個材料（表1），均由西北農林科技大學甘藍研究室提供。供試甘藍黑腐病菌株為致病力較強的甘藍黑腐病菌株YU[17]，該菌株由西北農林科技大學甘藍研究室提供。

牛肉膏蛋白胨固體培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L、pH 7.2;牛肉膏蛋白胨液體培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母粉1 g、葡萄糖10 g、蒸餾水1 L、pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 幼苗培養 試驗于2019年3—10月在西北農林科技大學試驗基地日光溫室進行，將5個材料的種子先在75%酒精中處理1 min，再用滅菌蒸餾水沖洗2～3次后，于25 ℃培養箱內催芽2 d，選取發芽一致的種子播種于50孔穴盤（540 mm × 270 mm × 50 mm）基質中，所用基質提前進行滅菌處理，育苗盤置于日光溫室中正常生長。

1.2.2 病原菌接種方法和抗性類型劃分 接種材料準備：供試甘藍材料幼苗長至一定時期時，將幼苗澆透水并覆蓋塑料薄膜保濕24 h（25 ℃/19 ℃）。

黑腐病菌懸浮液制備：將4 ℃保存的菌株YU于牛肉膏蛋白胨固體培養基上活化24 h，挑取活化的菌株于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28 ℃、190 r·min-1條件下振蕩培養18 h，用無菌水調節濃度用于接種。

接種：用小型噴霧器將配制好的菌液均勻噴灑到植株葉片上，每株幼苗平均噴施1 mL左右，以葉片無液滴滴落為宜，以噴施無菌水為空白對照，3次重復，每次重復16株。接種后繼續用薄膜保濕，之后除去薄膜將幼苗放置光照14 h、濕度90%下栽培生長。整個試驗采用完全隨機設計，接種后數日開始調查發病情況（每株幼苗隨機選2片真葉進行調查），統計發病級別，計算病情指數，進行抗性類型劃分。

病情指數計算和抗性類型劃分：病情指數（Disease Index，DI）=Σ（病級葉數×該病級值）/（調查總葉數×最高病級）×100。抗性類型（Resistance Type，RT）劃分：依據甘藍材料的葉片病情級別，分別計算出DI平均值，進而確定其抗性類型。

1.2.3 病原菌接種后最適保濕和發病調查時間確定 用小型噴霧器將濃度為1×108 CFU·mL-1的菌液均勻噴施到3葉1心期的供試甘藍幼苗上，分別設置塑料薄膜保濕0、12、24、36、48 h等5個處理，每個處理3次重復，每次重復16株幼苗。接種后的幼苗置于28 ℃/19 ℃光照14 h培養箱內培養;接種后分別于7、9、12、16 d調查發病癥狀，比較5個材料的田間自然抗病性與苗期接種黑腐病的抗病性，篩選病原菌接種后的最適保濕條件和發病調查時間。

1.2.4 病原菌接種最適濃度和溫度確定 利用血球計數板分別配置1×105、1×106、1×108、1×1010 CFU·mL-1等4種濃度的黑腐病病原菌懸浮液，用小型噴霧器于3葉1心期的甘藍幼苗進行噴霧接種，采用1.2.3確定的最適保濕時間和發病調查時間，將接種后除去薄膜的甘藍幼苗置于光照培養箱內培養（光14 h/暗10 h），溫度分別設置26 ℃/19 ℃、28 ℃/19 ℃、30 ℃/19 ℃等3個處理，濕度90%下培養;每個處理3次重復，每次重復16株。比較5個材料的田間自然抗病性與苗期接種黑腐病的抗病性，篩選病原菌接種后的最適濃度和溫度。

1.2.5 病原菌接種最適苗齡的確定 采用1.2.3和1.2.4確定的保濕時間、發病調查時間、接種濃度和溫度，設置1葉1心、2葉1心、3葉1心、4葉1心、5葉1心等5個接種苗齡處理。接種后幼苗于光照培養箱培養，濕度90%，每個處理3次重復，每次重復16株。比較5個材料的田間自然抗病性與苗期接種黑腐病的抗病性，篩選病原菌接種的最適苗齡。

1.2.6 甘藍不同種質資源材料的抗病性鑒定 采用本試驗中建立的甘藍黑腐病苗期抗性鑒定方法，對國內外引進的44份甘藍種質資源進行苗期抗病性鑒定，以高抗材料QK2502和感病材料QG50作為對照，根據鑒定結果選擇有代表性的10份材料進行重復鑒定與驗證。

1.3 數據處理

采用Excel 2007和SPSS 17.0對數據進行統計分析，采用Duncans多重比較法分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 甘藍苗期感染黑腐病分級標準確定

甘藍苗期接種黑腐病菌的癥狀表現為病斑從葉片水孔處的褪綠斑點逐漸擴展，顏色由黃色逐漸變為褐色，后期變為黑色。根據癥狀特征分析，在國家甘藍攻關組“八五”確定甘藍苗期黑腐病病情分級標準[18]的基礎上進一步修改完善;建立如下分級標準：0級，接種葉片無任何癥狀;1級，接種葉片水孔處有黑色枯死斑點，無擴展;3級，接種葉片病斑從水孔向外擴展，占葉面積1/16以下;5級，接種葉片病斑從水孔向外擴展，占葉面積1/16～1/4;7級，接種葉片病斑從水孔向外擴展，占葉面積1/4～1/2;9級，接種葉片病斑從水孔向外擴展，占葉面積1/2以上，見圖1。

2.2 甘藍黑腐病苗期接種鑒定最適保濕時間和發病調查時間的篩選

由表2可知，接種病菌后不同保濕和發病調查時間處理對5個材料病情指數的影響存在顯著差異。鑒定表現出隨著保濕時間的增加，5個材料的病情指數均呈現不同程度的增加趨勢，且在不同保濕時間內均隨著調查時間的延長，其幼苗的發病程度則相應的加重。從5個材料田間自然抗、感黑腐病的真實性與苗期接種鑒定抗性的一致性分析，僅有保濕24 h和36 h處理下，接種后12 d調查，5個材料苗期接種鑒定的抗、感病癥狀與其田間自然抗感性呈現一致，分別表現為QK2502（HR）高抗、QG70（R）抗病、LQ66（MR）中抗、QG50（S）感病、B02（HS）高感。在每個保濕時間下7 d和0、12 h保濕時間下9 d調查時，5個材料均發病較輕，QG70（R）病情指數均 ≤ 9.49，表現為高抗;在36 h、48 h保濕時間下9 d調查時，B02（HS）病情指數分別為62.50和69.44，表現為感病;在0、12 h保濕時間下12、16 d調查時，材料B02（HS）病情指數 ≤ 67.59，呈現偏小現象，表現為中抗或感病;在48 h保濕時間下12 d調查或24 h、36 h和48 h保濕時間下16 d調查時，感病QG50表現為高感;這些條件下的結果均不能真實地鑒定出5個材料的抗病性。即在篩選確定保濕24 h或36 h處理下第12天調查為適合苗期接種鑒定條件中，相比較5個材料中高感與高抗材料的病情指數差值，保濕24 h時差值為70.14、保濕36 h時差值為73.61。由此得出，苗期接種鑒定抗病性36 h和12 d時為最適保濕和發病調查時間。圖2為5個材料在接種后保濕36 h、12 d時的發病癥狀。

2.3 甘藍黑腐病苗期接種鑒定最適接種濃度和溫度的篩選

由表3可知，甘藍苗期黑腐病菌接種后不同接種濃度而相同溫度處理時，5個材料的病情指數均呈現出隨接種濃度的增大而增大的趨勢;在接種濃度相同而溫度處理不同時，5個材料病情指數均呈現出隨處理溫度增高而增大的趨勢。從5個材料田間自然抗感黑腐病的真實性與苗期接種鑒定抗性的一致性分析，僅在接種濃度為1×108 CFU·mL-1、溫度為26 ℃/19 ℃和28 ℃/19 ℃時，5個材料苗期接種鑒定的抗、感病癥狀與其田間自然抗感性呈現一致，分別表現為QK2502（HR）高抗、QG70（R）抗病、LQ66（MR）中抗、QG50（S）感病、B02（HS）高感。而其他接種濃度和溫度處理下均存在不一致性差別，其中溫度為26 ℃/19 ℃時，接種濃度為1×105 CFU·mL-1和1×106 CFU·mL-1處理下，5個材料均發病較輕，QG70（R）表現為高抗，LQ66（MR）表現為抗病，QG50（S）表現為中抗或抗病，B02（HS）表現為中抗或感病;接種濃度為1×1010 CFU·mL-1處理下，QG50（S）發病較重，病情指數為71.53，表現為高感。在溫度為28 ℃/19 ℃時，接種濃度為1×105 CFU·mL-1和1×106 CFU·mL-1處理下，植株發病程度較輕，QG70（R）表現為高抗，LQ66（MR）表現為抗病，QG50（S）表現為中抗，B02（HS）表現為中抗或感病;接種濃度為1×1010 CFU·mL-1處理下，QK2502（HR）和QG50（S）發病較重，分別表現為抗病（R）和高感（HS）。在溫度為30 ℃/19 ℃時，接種濃度為1×105 CFU·mL-1和1×106 CFU·mL-1處理下，B02（HS）發病較輕，表現為感病;接種濃度為1×108 CFU·mL-1和1×1010 CFU·mL-1處理下，QG50（S）發病較重，病情指數≥71.99，表現為高感，這些處理下的結果均不能真實地鑒定出5個材料的抗病性。由篩選確定溫度為26 ℃/19 ℃或28 ℃/19 ℃、接種濃度為1×108 CFU·mL-1處理為適合苗期接種鑒定條件中，相比較5個材料中高感與高抗材料的病情指數差值，接種溫度為26 ℃/19 ℃時差值為74.77、接種溫度為28 ℃/19 ℃時差值為73.84。由此得出，苗期接種鑒定抗病性1×108 CFU·mL-1和26 ℃/19 ℃為最適接種濃度和溫度。圖3為5個材料在溫度為26 ℃/19 ℃下培養至12 d時的發病癥狀。

2.4 甘藍黑腐病苗期接種鑒定最適接種苗齡的篩選

由表4可知，對甘藍不同苗齡的幼苗接種黑腐病菌，QK2502不同苗齡間病情指數存在極顯著差異，其他4個材料不同苗齡間病情指數差異水平不同。鑒定表現出5個材料的病情指數均呈現隨苗齡增大而減小的趨勢，即幼苗發病程度重。對照5個材料田間自然抗感黑腐病的真實性與苗齡接種鑒定抗性的一致性分析，接種選在幼苗3葉1心期或4葉1心期，5個材料苗期接種鑒定抗感病的癥狀與其田間自然抗感性呈現一致性，分別表現為QK2502（HR）高抗、QG70（R）抗病、LQ66（MR）中抗、QG50（S）感病、B02（HS）高感;而其他接種苗齡均存在不一致性差別，接種在1葉1心期或2葉1心期時，QG50（S）發病均較重，表現為高感;而接種在5葉1心期時，幼苗發病較輕，QG70（R）表現為高抗，LQ66（MR）表現為抗病。結果表明，這些苗齡下的鑒定結果均不能真實地判別出5個材料的抗病性。在由篩選得出適宜接種的苗齡即為3葉1心期或4葉1心期中，相比較5個材料中高感與高抗材料間病情指數差值，其3葉1心期接種時差值為72.22、4葉1心期接種時差值為71.99。由此得出，甘藍黑腐病苗期抗性鑒定接種的最適苗齡是3葉1心期。圖4為5個不同抗性甘藍材料在3葉1心期接種12 d時的發病癥狀。

2.5 甘藍種質資源苗期黑腐病抗性鑒定與篩選

由表5可以看出，采用篩選確立的甘藍黑腐病苗期抗性鑒定方法對44份甘藍種質資源材料進行黑腐病抗性鑒定，結果表現出供試甘藍種質資源材料間病情指數存在極大差別，各材料間抗感性分化非常明顯。對黑腐病抗性分類的結果為：高抗材料10份，抗病材料11份，中抗材料9份，感病材料8份，高感材料6份，分別占鑒定資源材料的22.73%、25%、20.45%、18.18%和13.64%;苗期接種鑒定所得結果與供試44份種質資源材料歷年在田間黑腐病圃的自然鑒定抗感性結果基本一致。與此同時，從這44份資源材料的每個抗性級別中隨機選出2份材料進行重復鑒定，2次鑒定結果完全吻合，并且2次鑒定的供試抗、感對照品種也均表現出典型的抗、感特征，由此得出，研究建立的甘藍黑腐病苗期抗性鑒定方法可行，其鑒定資源材料的抗病性結果準確、真實。

3 討論與結論

建立甘藍苗期抗病性鑒定方法既要符合田間發病期病原菌的適宜發病環境，也要考慮甘藍植株自身生長狀況與抗病性關系;并要接種鑒定選用致病力較強的病原菌和選擇甘藍幼苗的旺盛生長期，才能真實地表現出甘藍資源的抗感性能。黑腐病是甘藍作物的主要病害，病原菌主要通過水孔和傷口侵入甘藍體內;甘藍感染病原菌自身也會產生應激反應，抵抗病原菌危害并逐漸在侵入周圍表現感病癥狀。對于甘藍黑腐病苗期抗性鑒定接種方式，前人采用剪葉法[19]、針刺法[20-21]等，這是人為造成傷口有利于病原菌入侵，但某種程度會降低甘藍的抗御能力，傷口接種易導致植株感病加重。筆者在本研究中采用噴霧接種，模擬了田間黑腐病菌自然侵染途徑[22]，使甘藍植株處于自然生長狀態，體內防御體系健全，能使甘藍資源對黑腐病的抗感反應表現出真實性。

甘藍黑腐病發病的重要條件是具有適宜的高溫和高濕環境，這樣才可能充分保證黑腐病菌的強致病力和保證病菌在葉面上的黏著性，同時也能保證甘藍葉面水孔的開放性，便于病原菌入侵;干旱或缺濕易導致甘藍葉面蠟粉增多，水孔關閉，病原菌不易侵染葉片。本研究得出，進行甘藍黑腐病抗性苗期接種鑒定，接種病原菌后保濕36 h、12 d時調查幼苗感病程度才能客觀地判別甘藍資源的抗病性。如果保濕時間或幼苗感病癥狀調查時間過長或過短均會導致病害加重或減輕，從而影響甘藍資源抗病性真實性的鑒定;這與前人[23-25]研究的結果有所不同。

病原菌接種濃度直接決定著植物感染病害的發病程度，溫度是影響植物和微生物生活力的主要因子，二者共同決定著病原菌的致病力和植物受病菌的傷害程度。病原菌侵染寄主并不是濃度越高致病力就越強，對于不同作物它有一個致病力最強的濃度適宜范圍。本研究得出甘藍幼苗接種黑腐病菌抗性鑒定適宜濃度為1×108 CFU·mL-1，接種溫度為26 ℃/19 ℃時就能明顯地區別出抗感資源的抗性差異。這個結論也表明在適宜接種病原菌濃度下，26 ℃/19 ℃接種溫度正是野油菜黃單胞菌（Xcc）最適生長溫度，同時此溫度對甘藍生長也相對有利;如果溫度 ≥ 28 ℃，甘藍生長減緩，抗逆性減弱，相應的就加快了植株的發病進程，此時會導致感病加重。筆者這種認識與Staub T[26]在研究十字花科作物黑腐病抗性鑒定方法時認為過高接種濃度和接種溫度會導致鑒定材料抗病性降低的觀點相同。田間甘藍黑腐病多發生在每年8—9月，此時溫度25～30 ℃，降水較多，這與筆者的研究結果相吻合。

病害抗性鑒定選擇的接種苗齡是影響甘藍抗病性鑒定真實表達的重要因素之一。筆者認為甘藍不同苗齡接種黑腐病菌，導致幼苗發病程度的輕重差異不同;苗齡越小發病越重，苗齡越大發病越輕;而能真實地代表甘藍資源本身抗病特性的接種苗齡是幼苗生長中期，即3葉1心期或4葉1心期。這也再次表明筆者認為建立甘藍苗期抗病性接種鑒定方法除應選用當地強致病力的病原菌外，還需選在甘藍幼苗生長的最旺盛期接種。甘藍一般分為2/5和3/8葉環，第1葉環為苗期，生長5片或8片真葉代表苗期結束。也正因為3葉1心期或4葉1心期是2/5和3/8葉環幼苗生長中期，此時甘藍幼苗根系發育健全，體內代謝旺盛，生長勢最強;而選擇此時接種病原菌鑒定抗病性也最具代表性。

綜上所述，當幼苗生長至3葉1心期時，選用當地強致病力的黑腐病菌株YU，配制濃度為1×108 CFU·mL-1的病菌懸浮液，采用噴霧法接種，接種后90%濕度下保濕36 h，在光14 h/暗10 h、溫度26 ℃/19 ℃培養條件下誘發病害發生，于12 d時調查幼苗發病程度，依據甘藍資源材料的病情指數就能夠準確、可靠地鑒定其抗病類型。

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