Taz及Runx2在大鼠下頜第一磨牙發育中的表達研究

張 冰，徐 欣

PDZ結合基序的轉錄輔激活物 (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, Taz)是Hippo信號通路下游重要的效應因子，作為一個包含WW結構域的轉錄共激活因子，其在哺乳動物的多種組織器官發育中發揮著重要的調控作用[1-3]。Taz可以通過上調Runt相關轉錄因子2 (Runt-related transcription factor 2,Runx2)，激活Smad信號通路及骨鈣蛋白的表達，此外，Taz與14-3-3蛋白相互作用可以調控干細胞的分化[4]。上述研究提示Taz可能在骨生成或者某些硬組織形成過程中起重要作用。Runx2是成骨細胞分化過程中起重要作用的轉錄因子[5-6]，參與調控骨和牙齒的發育及牙齒的礦化[7-8]。有研究發現Runx2與Taz在促進成骨細胞分化的過程中存在相互作用關系[9]，但在牙齒發育中二者是否具有相關性尚不明確。本研究采用免疫組織化學的方法觀察Taz、Runx2在大鼠下頜第一磨牙發育過程中的表達，以明確其時空特異性表達規律，為深入探究二者在牙齒發育中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar大鼠(10周齡)(山東大學實驗動物中心)，Taz多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，Runx2多克隆抗體(Abcam公司，美國)，免疫組織化學SABC二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，其余所需試劑及設備均由山東省口腔組織再生重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 獲取標本 10周齡Wistar大鼠(由山東大學動物實驗中心提供，實驗設計經山東大學口腔醫院動物倫理委員會批準通過，倫理審批號：GD202036)雌雄2∶1交配，次日檢栓，發現陰栓視為受孕，當天中午即為受孕0.5 d。分別取胎齡14.5(E14.5)、E16.5、E18.5天大鼠胚胎頭顱標本(各4例)及出生后0(PN0)、PN3及PN7、PN14、PN21、PN28天大鼠下頜骨標本(各4例)，4 ℃條件下常規組織固定24 h(4%多聚甲醛，pH=7.2)、脫鈣(10% EDTA，pH=7.2)、脫水(梯度乙醇)及石蠟包埋。大鼠胚胎頭顱標本行冠狀面5 μm石蠟連續切片，大鼠下頜骨標本行矢狀面5 μm石蠟連續切片。經蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組織化學染色分別從形態學上觀察磨牙的發育狀況，從蛋白水平上檢測Taz、Runx2的表達。

1.2.2 免疫組織化學染色 石蠟切片二甲苯脫蠟3次(10 min/次)，梯度乙醇下行水化處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH=7.2)漂洗3次(5 min/次)，0.1%胰酶37 ℃孵育10 min進行抗原修復，PBS漂洗3次，3%過氧化氫37 ℃孵育20 min，以阻斷內源性的過氧化氫酶。正常山羊血清封閉30 min后去除多余血清勿漂洗，滴加Taz抗體(1∶300)或Runx2抗體(1∶400)濕盒內4 ℃條件下過夜。次日，切片于室溫下復溫30 min，PBS漂洗3次，滴加生物素標記二抗，37 ℃孵育25 min，PBS漂洗3次，滴加酶結合物，37 ℃孵育25 min，PBS漂洗3次，由顯微鏡下控制DAB顯色。免疫組織化學蘇木素復染，梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用PBS代替Taz、Runx2抗體4 ℃過夜，其余條件相同。

2 結 果

2.1 HE染色

牙齒的發育始于口腔上皮的增厚，E14.5天時牙板向間充質細胞中內陷形成花蕾狀(圖1)。隨著細胞進一步增殖、分化，E16.5天時成釉器分化為3層細胞即內釉上皮層、外釉上皮層和星網狀層，此期成釉器為帽狀期(圖1)。釉結作為一個臨時性的結構呈密集的細胞團狀，參與多種信號的表達調控，在牙齒形態的發生中起關鍵作用。在PN7天可見雙層結構的上皮根鞘，上皮根鞘開始向根方增殖、延伸啟動了牙根發育的形態學信號(圖2)。PN14至PN28天，由牙囊的間充質細胞分化而形成的牙骨質、牙周膜、牙槽骨等結構完成了牙周組織的發育，根尖孔逐漸縮窄，牙根的發育逐步完成(圖2)。

2.2 Taz、Runx2在胚胎期大鼠下頜第一磨牙牙胚中的表達與定位

在E14.5天即蕾狀期， Taz在口腔上皮及其周圍的間充質細胞中均有陽性表達，Runx2在蕾狀期表達廣泛(圖1)。在E16.5天，隨著牙胚的發育成釉器形狀似帽子，在釉結、牙乳頭及牙囊部分細胞中都存在Taz、Runx2的陽性表達，此外，Taz在口腔上皮中仍呈陽性著色(圖1)。至E18.5天的鐘狀早期，Taz的陽性表達主要集中于內釉上皮層、外釉上皮層、中間層及牙囊處，在牙乳頭及星網狀層中的表達較弱，而Runx2的表達在鐘狀早期則主要集中于內釉上皮層、中間層、牙乳頭及牙囊中(圖1)。

2.3 Taz、Runx2在出生后大鼠下頜第一磨牙發育中的表達與定位

當牙胚發育至PN7天時，牙冠的發育即將完成，在成釉細胞、成牙本質細胞層、牙本質基質、中間層及上皮根鞘中存在Taz及Runx2的陽性表達， 此期成牙本質細胞在牙尖部位為高柱狀，向根尖方向逐漸呈現扁平狀(圖2)。至PN14天時，牙冠的發育已經完成，在成釉細胞層中Taz的表達逐漸減弱；在此期的成牙本質細胞、牙本質小管及上皮根鞘處仍可見到Taz與Runx2兩種蛋白的陽性表達(圖2)。在牙齒發育至PN21及PN28天時，在近牙冠處的成牙本質細胞中Taz的表達較強，向根尖方向表達逐漸減弱，在根部成牙本質細胞及牙本質基質中Taz的表達呈弱陽性(圖2)。Runx2在成牙本質細胞及牙本質小管中表達呈陽性。牙周膜即牙周韌帶，是牙周組織中起支持作用的重要結構，為連接牙骨質和牙槽骨的結締組織，在PN21及PN28天的免疫組織化學染色中發現Taz、Runx2在牙周膜及牙槽骨中也存在陽性著色(圖2)。

eo: 成釉器; me: 間充質細胞; ek: 釉結; oee: 外釉上皮層; dp: 牙乳頭; iee: 內釉上皮層; df: 牙囊； oe: 外釉上皮

3 討 論

牙齒的發育是一個連續、復雜的上皮與間充質相互作用的過程，許多信號分子參與調控細胞增殖、分化及牙齒形態的發生[10-12]，轉錄共激活因子Taz是一個14-3-3結合蛋白[2,13]，為Yap的旁系同源蛋白，二者在蛋白質結構上有45%的相似性[2]。研究發現Yap/Taz是Hippo信號通路下游重要的效應因子，參與多種組織器官發育，二者在間充質干細胞的分化中也發揮重要作用[3]。有研究報道在小鼠正常切牙發育過程中Yap參與調控干細胞的增殖及分化[14]，此外，Yap過表達可以影響細胞極性及牙齒形態的發生[15]。作為Yap的同源蛋白，Taz在牙齒發育過程的調控作用及機制目前報道尚不多見。Runx2是成骨細胞標記基因(例如骨橋蛋白、骨涎蛋白、骨鈣蛋白等)的一個關鍵調控因子，為Runt家族的一員，具有高度保守的DNA結構域。研究發現Runx2不僅參與成骨細胞分化和骨形成的過程，同時在牙胚形成、牙齒礦化及牙周組織的發育中起重要的調控作用。近年的研究證實，Runx2的轉錄共激活功能是通過Taz實現的，在成骨細胞分化過程中Taz作為一個轉錄共激活劑在細胞核中的定位可激活Runx2的表達，從而促進骨的形成[16]。本研究通過免疫組織化學的方法觀察Taz與Runx2在牙齒發育中的表達與定位，探討二者在牙齒發育中的作用。

研究結果顯示，在蕾狀期，Taz、Runx2兩種蛋白在口腔上皮及周圍的間充質細胞中呈陽性表達；當牙胚發育至帽狀期，Taz、Runx2的陽性著色存在于牙囊、牙乳頭及釉結，此外，Taz在口腔上皮中仍存在表達。隨著牙胚的發育Taz的表達逐漸增強，至鐘狀早期，整個成釉器的各層細胞及牙囊中均呈陽性表達，Runx2的表達多集中于內釉上皮層、中間層、牙乳頭及牙囊。有研究報道Runx2可能調控多個信號通路的多個基因，在由蕾狀期向帽狀期過渡的牙胚早期發育中發揮重要作用[17]，基于Taz與Runx2在牙胚早期相似的特異性表達與定位，我們推測Taz可能在牙胚早期發育過程中也發揮著重要的作用。此外，釉結呈密集的細胞團狀，是調控牙齒形態重要的臨時性結構[18-20]。Li 等[21]的研究報道釉結是蕾狀期形成的重要結構，釉結的主要功能是分泌一系列的信號分子，共同調節牙齒形態的發生。釉結的形成主要依賴于αE-catenin通過Yap及其同源物Taz的信號傳遞功能。αE-catenin在牙齒發育過程中的粘附功能與其在釉結形成中的作用是分離的，釉結形成涉及到Yap/Taz信號通路的調控。本研究中免疫組織化學染色顯示Taz在釉結處存在陽性著色，提示Taz可能參與牙齒形態的發生過程中信號通路的調控，與Li等的研究相近，但本研究尚未進行深入機制的研究及探討。大鼠下頜第一磨牙牙胚的免疫組織化學染色發現，在PN7天牙冠的發育即將完成，在成釉細胞、成牙本質細胞層及牙本質基質中Taz的陽性著色最為明顯，除此之外，在中間層及上皮根鞘處也檢測出Taz的表達，表明Taz可能參與成釉細胞和成牙本質細胞的分化及釉質和牙本質的形成，同時在牙根的發育中也起到一定的調控作用。隨著牙冠發育的完成，Taz在成釉細胞中的表達減弱，在成牙本質細胞中的陽性著色由牙冠向根尖方向逐漸降低。至PN21、PN28天，在牙周膜及牙槽骨等牙周組織中可發現Taz與Runx2均存在特異性表達。根據以往的研究發現，Taz與Runx2的相互作用可以促進成骨因子的表達，因此，我們推測Taz可能通過對Runx2的調控實現對牙槽骨、牙周膜等牙周組織發育的調節。

ab：成釉細胞；ob：成牙本質細胞；em：釉質基質；d：牙本質；PDL：牙周膜；AB：牙槽骨；HERS：上皮根鞘

本實驗通過免疫組織化學染色觀察Taz、Runx2在大鼠下頜第一磨牙發育中的時空特異性表達，結果發現Taz與Runx2的表達與定位具有一定的一致性，推測Taz可能參與牙齒發育的調控，此外，Taz可能通過調控Runx2的表達參與成釉細胞和成牙本質細胞的分化及牙根和牙周組織的發育。然而，對于具體的調控機制尚不明確仍需進一步的探索研究。