不同滲透時間對窩溝封閉邊緣封閉性能的影響

周紅艷，張曉旻，曹 靈，王 玨，梅予鋒

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

Estiseal F光固化窩溝封閉劑、35%GLUMA釉質酸蝕凝膠(Heraeus，德國)；37 ℃恒溫培養箱(精宏，中國上海)；4 ℃冰箱(海爾，中國山東)；抗酸指甲油(Maybelline，美國)；低速切割機(Isomet 1000，美國)；體視顯微鏡XTB-1型(江南光學儀器廠)；低速杯狀刷(TPC，美國)；高速1/2球鉆(FG1/2，DENSPLY，美國)；原子力顯微鏡(Veeco，Autopbobe CP-R型，美國)。

1.2 方法

1.2.1 標本選擇 2017年7月—10月在南京醫科大學附屬口腔醫院頜面外科收集50顆因阻生拔除的下頜第三磨牙。納入標準：牙體完整，無齲壞，無磨耗，無隱裂，無染色，無釉質發育不良，深窩溝明顯。4 ℃生理鹽水浸泡保存。深窩溝的標準為:肉眼觀察離體牙，看不到窩溝底部，可以插入或卡住探針[4]。

1.2.2 樣本分組與操作方法 將50 顆離體牙隨機編號分組，每組10顆，共5組。使用1/2球鉆對窩溝進行釉質成形[5]，35%磷酸酸蝕30 s，沖洗后干燥，涂封閉劑，組1即刻光照40 s 使其固化。組2、3、4、5組標本分別停留15 s、30 s、45 s、60 s后光固化40 s。

窩溝封閉完成后要求所有深窩溝均被窩溝封閉劑覆蓋，并探診光滑，無氣泡。然后將樣本浸泡于37 ℃生理鹽水中24 h，分別浸入5 ℃和55 ℃蒸餾水中進行500個溫度循環，每個溫度停留30 s。用浸蠟法包裹整個牙根，對距封閉劑邊緣1.0 mm外的牙冠涂布3層指甲油，待指甲油干燥后，將樣本浸泡于37 ℃ 1%的亞甲基藍溶液中24 h后取出，流水沖洗24 h，于4 ℃蒸餾水中儲存。截除牙根，用蠟塊固定牙冠，用低速切割機沿近遠中[6]窩溝片切標本，每個樣本得到2個切片，共100個切片。

1.2.3 滲透率和微滲漏測定 分別由兩位檢查者在帶測微器目鏡的體視顯微鏡( ×30)下，對每個切片進行檢測，Kappa 值為0.87。測量方法參考Bahar法[7]。測量并記錄切片中最深窩溝內封閉劑滲透深度的網格數(e)、窩溝深度的網格數(e+f)及染料滲漏的網格數(a+c)、封閉劑與窩溝交界面的網格數(b+d)[8](圖1)。封閉劑滲透率=e÷(e+f)×100%，微滲漏率=(a+c)÷(b+d)×100%。

圖1 測量方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of measurement method

1周后，重復測定，每個切片經過2次評估共有4次測定值，記錄其平均值。

1.2.4 原子力顯微鏡的超微結構觀察 根據體視顯微鏡結果選取即刻組及30 s組切片固定于硬組織切片機上，平行切片，切成約1 mm厚硬幣大小，徹底干燥保存。將樣品固定在原子力顯微鏡XY掃描臺上，用監視器定位樣本的封閉劑-釉質交界面，在大氣中進行掃描成像。儀器工作方式為輕敲式，MPP-11123-10硅探針，所用的微懸臂力常數為20～80 N/m， 掃描長度為5 μm。利用儀器自帶的軟件(Image Processing Software Version 2.1)進行圖像數據的采集。

1.3 統計學方法

數據采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，使用K個獨立樣本非參數檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 滲透及微滲漏情況

窩溝封閉不同滲透時間組的滲透率與邊緣微滲漏率見(表1)。隨著滲透時間的增長，封閉劑的滲透率明顯增加，在30 s時達到高峰，45 s及60 s時滲透率又平緩下降。K個獨立樣本非參數檢驗顯示，5組的滲透率有統計學差異(P=0.031)，即刻固化組與30 s、45 s及60 s組均有顯著差異(P<0.05)，其余各組之間無統計學差異(P>0.05)。而各組的邊緣微滲漏率無統計學差異(P>0.05)。

表1 不同滲透時間組封閉劑的滲透率及微滲漏率 Tab.1 Penetration rates and microleakage rates of sealant in different groups

2.2 原子力顯微鏡觀察結果

即刻組及停留30 s組的二維圖像均顯示明顯的樹脂突，清晰規則，三維圖像顯示樹脂突密集排列，樹脂突長度無顯著差異。見圖2、3。

3 討 論

窩溝封閉作為預防窩溝齲的一種有效方法已被許多研究證實，并被臨床廣泛接受[9-11]。窩溝封閉通過保護牙釉質不受細菌及代謝產物的侵蝕，以及斷絕原來存在于窩溝中細菌的營養來源這兩種作用機制，有效預防乳、恒牙窩溝齲的發生[12]。

樹脂類窩溝封閉劑是一種高分子材料，具有良好的流動性，可以滲入狹窄的窩溝底部[13]。理論上，流動時間延長， 窩溝封閉劑滲透的深度應增加。本研究結果表明光照之前停留滲透30 s可以使封閉劑的滲透深度及封閉劑與牙面之間的密合性達到最優化，滲透30 s以上封閉劑的滲透深度并沒有繼續明顯增加，微滲漏率也并沒有顯著減少；相反，隨著滲透時間的增加，其滲透深度的平均值略有降低，微滲漏率也略有升高，但是與滲透30 s組的實驗結果并沒有顯著差異。

1987年Chosack等[14]研究了光照之前滲透時間分別為0.5 s、5.0 s、10.0 s及20.0 s的樹脂突長度，結果發現滲透20.0 s可以使封閉劑形成的樹脂突達到最長。Meyer-Lueckel等[15]在2006年研究了5種粘結劑及1種封閉劑分別在滲透15、30 s后滲透進牛牙釉質表面損害的能力，他們的研究結果顯示滲透時間增加，其材料的滲透深度及均一性均顯著增加。

A：二維圖，顯示明顯的樹脂突，清晰規則；B：三維圖，顯示樹脂突密集排列，長度一致

A：二維圖，顯示樹脂突明顯清晰，排列規則均勻；B：三維圖，顯示樹脂突長度一致，排列密集

窩溝封閉劑被特定波長的光源照射后，很快聚合固化，失去流動性。如果光照之前窩溝封閉劑有足夠的時間來滲透，則其滲透深度可達到最大化，不會產生與牙面之間的縫隙，與牙面達到良好的密合性，即不會產生微滲漏。因為光固化樹脂暴露于環境光線中較長時間時也會逐漸固化[16]。同理臨床操作時，如果滲透時間延長，由于環境光源的影響，樹脂類封閉劑表層也會緩慢固化，影響了封閉劑的流動，導致表層下的封閉劑固化不全或固化不均勻，使深窩溝最底處封閉不全且密合不良；同時臨床操作時滲透時間延長，增加了唾液污染的風險，并不能產生理論上最大的滲透深度與最小的微滲漏。Hosseinipour、張曉曉等均研究證實唾液污染后窩溝封閉的微滲漏明顯增加[17-18]。Gawali等[19]研究發現唾液污染后疏水性封閉劑材料滲透深度明顯減少。

Chosack等[14]通過觀察發現臨床使用光固化封閉劑通常不超過5 s即光照，并且由于兒童配合程度的影響，幾乎都是即刻光照。光固化封閉劑因易控制，操作時間短，縮短了對幼兒控制唾液污染的時間等優點在臨床廣受歡迎。臨床中如果為了獲得最佳的滲透深度而使滲透時間延長，同時又要防止唾液污染，則必須保證完全的隔濕與干燥。

原子力顯微鏡一般有3種工作模式:接觸模式(contact mode)、非接觸模式(non-contact mode)和敲擊模式(tapping mode)[20]。3種模式各有特點，可根據樣品性質及實驗需求選擇不同模式。其中敲擊模式不僅減少了接觸模式下掃描時針尖對樣品表面的影響，又具有比非接觸模式高的分辨率，適合樹脂突超微結構研究，因此本研究選擇了敲擊模式。關于掃描電鏡觀察口腔科材料超微結構的文獻很多，原子力顯微鏡在口腔研究中的應用逐漸廣泛，Tuncay等[21]利用原子力顯微鏡研究樹脂根管封閉劑表面硬度，Keinan等[22]用原子力顯微鏡觀察牙釉質的形態結構，但是關于原子力顯微鏡觀察封閉劑樹脂突的實驗較少，因此本實驗嘗試用原子力顯微鏡觀察封閉劑樹脂突的形成情況。

本實驗結果提示，臨床操作窩溝封閉中，光照之前使封閉劑有最佳的滲透時間，可以獲得良好的邊緣封閉性能，期待進一步研究證實，以望臨床應用。